偽狂犬病病毒EP0基因的克隆及原核表達

周慧英，程 藝，孫磊磊，王 雨，吉藝寬，任 濤，琚春梅

（華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，廣東廣州510642）

偽狂犬病病毒（Pseudorabies viurs，PRV）屬皰疹病毒科（Herpesviridae），α-皰疹病毒亞科（Alpha-herpesvirinae）。該病毒可感染多種動物，豬為其貯存宿主，且可引起潛伏感染［1］。早期蛋白0（early protein 0，EP0）是目前已知的3個PRV早期蛋白之一。研究表明，EP0可以促進PRV立即早期蛋白（immediate-early protein）基因IE180、糖蛋白G （glycoprotein G，gG）（gX）、胸苷激酶（thymidine kinase，TK）啟動子的轉(zhuǎn)錄，在與IE180蛋白共同作用下，EP0蛋白激活TK和gG（gX）啟動子轉(zhuǎn)錄的效率更高［2-3］。Ono等［2］研究表明EP0蛋白可提高病毒基因組DNA的感染性，有利于病毒粒子的復(fù)制。

對EP0蛋白結(jié)構(gòu)域的研究表明，該蛋白中存在與鋅指結(jié)構(gòu)類似的環(huán)指結(jié)構(gòu)域，是結(jié)合DNA、RNA及蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的區(qū)域，但與EP0蛋白同源性很高的單純皰疹病毒1型（Herpes simplex virus type 1，HSV-1）的ICP0、水痘-帶狀皰疹病毒（Varicella-zoster virus，VZV）的 ORF61和馬皰疹病毒1型（Equine herpes virus 1，EHV-1）的基因63的產(chǎn)物已被證明并不結(jié)合DNA、RNA［4］，因此EP0蛋白可能在蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用方面具有重要作用。對與PRV同屬α-皰疹病毒的HSV-1ICP0的研究證實了該蛋白與病毒粒子中的ICP4、VP22等均存在相互作用［5］。Guo H 等［6］對EP0蛋白的研究發(fā)現(xiàn)它能夠與至少6種核蛋白存在相互作用，推測EP0蛋白可能是通過與細胞的轉(zhuǎn)錄因子相互作用來發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能［7］。本研究擬在大腸埃希菌中對含有GST標簽的偽狂犬病病毒EP0基因進行表達，為深入研究EP0蛋白與宿主細胞及PRV病毒粒子中其他蛋白的相互作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒及菌株 偽狂犬病病毒強毒株分離株，大腸埃希菌 TOP10及BL21（DE3），表達載體pGEX-4T-1，均由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)微生物學(xué)與免疫學(xué)教研室保存。

1.1.2 試劑 LA Taq酶、限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ及NotⅠ、T4DNA連接酶，DNA Marker，IPTG、瓊脂糖均購自寶生物工程（大連）有限公司；蛋白質(zhì)Marker購自Fermentas公司；DNA凝膠回收試劑盒及質(zhì)粒抽提試劑盒購自O(shè)MEGA公司；羊抗鼠IgG-HRP購自廣州美津生物技術(shù)有限公司；偽狂犬病病毒EP0單克隆抗體由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)微生物學(xué)與免疫學(xué)教研室制備并保存［8］；LB肉湯培養(yǎng)基、瓊脂粉、蛋白酶K、氨芐青霉素、DAB、EB、尿素、β-巰基乙醇、溴酚藍、甘氨酸購自廣州康龍生物技術(shù)有限公司；丙烯酰胺、N，N-亞甲叉雙丙烯酰胺、SDS、四甲基乙二胺（TEMED）、過硫酸銨、考馬斯亮藍R-250，NC膜均購自北京鼎國生物技術(shù)有限責任公司。無水乙醇、甲醇、冰醋酸、氯仿、異戊醇、Tris堿、氯化鈉、氫氧化鈉等均為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 PRV基因組DNA的提取 將PRV病毒液反復(fù)凍融3次后，取500μL病毒液加入蛋白酶K（10mg／mL）5μL，100g／L SDS 25μL，50℃作用2 h～3h，加等量的苯酚∶氯仿∶異戊醇（25∶24∶1）充分混勻，12 000r／min離心10min。取上清液，如此重復(fù)2次～3次。取上清液加入2倍體積的無水乙醇室溫沉淀30min，12 000r／min離心10min棄上清，沉淀用750mL／L乙醇洗滌1次，風干后用100μL ddH2O或TE溶解，置-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 PRV EP0基因引物的設(shè)計與合成 參考GenBank登錄的偽狂犬病病毒EP0序列（AF298586），設(shè)計一對引物擴增EP0基因的完整編碼區(qū)。引物序列如下：EP0-F：5′-TAGGAATTCATGGGCTGCACGGACTCT-3′（下劃線部分為EcoRⅠ 酶 切 位 點），EP0-R：5′-TACGGCGGCCGCGTCGTCGTCCTGGGTGAG-3′（下劃線部分為NotⅠ酶切位點）。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.2.3 EP0基因的擴增與克隆 EP0基因PCR擴增條件為：95℃5min；95℃1min，56℃1min，72℃1.5min，35個循環(huán)；72℃ 10min。PCR 產(chǎn)物用DNA凝膠回收試劑盒進行回收。回收產(chǎn)物與pMD18-T載體連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸埃希菌TOP10感受態(tài)細胞，經(jīng)菌落PCR驗證后挑取陽性克隆，擴大培養(yǎng)后提取質(zhì)粒進行酶切鑒定，質(zhì)粒命名為pMD-EP0。

1.2.4 重組質(zhì)粒pGEX-EP0的構(gòu)建 用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和NotⅠ對pMD-EP0進行雙酶切，回收EP0基因后與經(jīng)同樣酶切回收的pGEX-4T-1在T4DNA連接酶作用下16℃連接過夜。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸埃希菌TOP10感受態(tài)細胞中，經(jīng)菌落PCR驗證后挑取陽性菌落接種于5mL含氨芐青霉素的LB中，37℃、200r／min搖床培養(yǎng)12h～16h，提取重組質(zhì)粒，命名為pGEX-EP0，并對重組質(zhì)粒進行酶切鑒定和序列測定。

1.2.5 重組質(zhì)粒的誘導(dǎo)表達與樣品處理 經(jīng)酶切鑒定和測序分析正確后，將抽提的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞BL21（DE3），挑取陽性菌落接種于含有氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，37℃、200r／min搖床培養(yǎng)14h作為一級種子，取100μL菌液加入到新的5 mL含有氨芐青霉素的LB中，37℃、200r／min搖床培養(yǎng)至OD 600nm值為0.6～0.8，加入IPTG（100 mmol／L）50μL，使其終濃度為1mmol／L，28℃繼續(xù)誘導(dǎo)5h。菌液12 000r／min離心1min，棄上清，再用PBS重懸菌體，加入等體積的2×SDS上樣緩沖液，煮沸10min進行SDS-PAGE及 Western blot檢測，同時設(shè)立pGEX-4T-1誘導(dǎo)對照、pGEX-4T-1未誘導(dǎo)對照及表達質(zhì)粒pGEX-EP0未誘導(dǎo)對照。

1.2.6 表達蛋白的Western blot分析 將表達的重組蛋白經(jīng)120g／L SDS-PAGE分離后，電轉(zhuǎn)移至NC膜上，用50g／L脫脂奶粉4℃封閉過夜；TBST洗滌3次，每次15min，加入PRV EP0單克隆抗體（1∶300稀釋），37℃孵育2h；TBST 洗滌3次，加入HRP（辣根過氧化物酶）標記的羊抗鼠IgG（1∶4 000）TBST洗滌3次，TBS洗滌2次，DAB顯色，以蒸餾水終止反應(yīng)。

1.2.7 表達條件的優(yōu)化 為了使目的蛋白的表達量最高，采用不同的IPTG濃度、不同的時間進行誘導(dǎo)表達，以優(yōu)化重組質(zhì)粒pGEX-EP0的誘導(dǎo)表達條件。

2 結(jié)果

2.1 PRV EP0基因的PCR擴增

以抽提的PRV基因組DNA為模板進行PCR擴增，獲得了特異性擴增條帶，與預(yù)期擴增片段1 227bp大小一致，電泳結(jié)果見圖1。

圖1 PRV EP0的PCR擴增結(jié)果Fig.1 The amplification of EP0gene by PRV

2.2 重組質(zhì)粒pGEX-EP0的酶切鑒定

將重組質(zhì)粒pGEX-EP0轉(zhuǎn)化大腸埃希菌TOP10，抽提重組質(zhì)粒，然后用EcoRⅠ和NotⅠ進行雙酶切鑒定，同時設(shè)立EP0PCR產(chǎn)物及pGEX-4T-1雙酶切回收產(chǎn)物的對照。結(jié)果見圖2。

2.3 pGEX-EP0表達產(chǎn)物的鑒定

將己構(gòu)建的重組表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸埃希菌BL21（DE3），經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，通過SDS-PAGE電泳表明EP0與GST的融合蛋白大小約為71.4ku，而pGEX-4T-1載體誘導(dǎo)表達的GST蛋白大小為26ku（圖3），Western blot結(jié)果顯示融合蛋白可與PRV EP0單克隆抗體反應(yīng)（圖4）。

圖2 重組質(zhì)粒pGEX-EP0的鑒定Fig.2 Identification of recombinant plasmid pGEX-EP0

圖3 表達蛋白的SDS-PAGE分析Fig.3 Analysis of the protein expression by SDS-PAGE

2.4 最佳誘導(dǎo)條件的確定

以不同IPTG濃度和時間對表達菌進行誘導(dǎo)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)IPTG濃度和誘導(dǎo)時間均能明顯地影響蛋白的表達量。由圖5可知重組蛋白在1.0mmol／L和1.5mmol／L的IPTG濃度誘導(dǎo)下表達量最高，選擇1.0mmol／L的IPTG濃度誘導(dǎo)可以減少ITPG的使用劑量，因此確定最佳誘導(dǎo)濃度為28℃，以1.0 mmol／L的IPTG濃度誘導(dǎo)。由圖6可知重組蛋白在5h時表達量最高，因此確定最佳誘導(dǎo)時間為5h。

圖4 表達蛋白的Western blot分析Fig.4 Analysis of protein expression by Western blot

圖5 不同濃度誘導(dǎo)表達蛋白的SDS-PAGE分析Fig.5 SDS-PAGE analysis of expression products of recombinant E.coli BL21（DE3）induced with different IPTG concentrations

3 討論

PRV能感染多種家畜和野生動物，可引起母豬發(fā)生流產(chǎn)、死胎、產(chǎn)木乃伊胎，新生仔豬大量死亡，育肥豬出現(xiàn)呼吸道癥狀等；除豬以外的其他動物發(fā)病后通常具有發(fā)熱、奇癢及腦脊髓炎等典型癥狀，均為致死性感染［9］。目前控制和消滅偽狂犬病所面臨的主要困難是該病毒的潛伏感染問題［10］。對與PRV同屬皰疹病毒科的HSV-1的研究證實，在潛伏感染期間，HSV-1ICP0蛋白可以使?jié)摲鼱顟B(tài)的病毒活化［11］。PRV EP0蛋白與HSV-1ICP0蛋白同源，因此推測EP0蛋白可能在PRV潛伏感染的激活中具有重要作用。

圖6 不同時間誘導(dǎo)表達蛋白的SDS-PAGE分析Fig.6 SDS-PAGE analysis of expression products of recombinantE.coli BL21（DE3）induced with different time

EP0蛋白作為早期蛋白在病毒感染過程中發(fā)揮著復(fù)雜的功能，已有研究證實EP0蛋白具有抑制vhs［12］及gE基 因 啟 動 子 的 作 用［13］。Tombácz D等［14］研究則顯示，在病毒感染的整個過程中，EP0蛋白對病毒基因的作用是不斷變化的，在感染早期EP0蛋白對IE180和其他早期基因的轉(zhuǎn)錄有促進作用，而在感染晚期對所有病毒基因的轉(zhuǎn)錄則有抑制作用，且抑制作用與反式激活蛋白存在劑量依賴性，如低濃度的IE180蛋白能促進病毒基因的表達，高濃度時則抑制表達，但在此過程中，EP0蛋白是直接發(fā)揮作用還是通過IE180等其他調(diào)控蛋白間接發(fā)揮作用有待進一步研究。此外，對PRV YS-81株的研究表明EP0蛋白能夠促進IE180、TK、和gG基因啟動子的轉(zhuǎn)錄［3］，而對PRV Ea株和Fa株的研究則發(fā)現(xiàn)EP0蛋白對IE180和TK啟動子的轉(zhuǎn)錄有抑制作用，究其原因可能與靠近環(huán)指結(jié)構(gòu)域的兩個氨基酸的不同有關(guān)［6］。

由于PRV DNA的G＋C含量高達73%，給PCR擴增帶來了很大困難，為獲得較好的擴增結(jié)果，在借鑒文獻［15］中程序的基礎(chǔ)上適當改進，結(jié)果EP0蛋白基因擴增效果較好。

本試驗選擇pGEX原核表達系統(tǒng)來表達偽狂犬病病毒EP0蛋白，該系統(tǒng)所采用的Ptac啟動子是一種最強的原核啟動子，可以使目的蛋白獲得高效表達，且表達的蛋白與谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶（GST）融合，便于表達蛋白的純化。本研究利用該系統(tǒng)成功表達了PRV EP0蛋白，且摸索了EP0蛋白表達的最佳IPTG誘導(dǎo)濃度及最佳誘導(dǎo)時間為28℃，1 mmol／L誘導(dǎo)5h。該結(jié)果為深入研究EP0蛋白與宿主細胞及病毒蛋白的相互作用奠定了良好的基礎(chǔ)。

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