雞新城疫病毒分離鑒定及其部分生物學(xué)特性的研究

郭利英

（內(nèi)蒙古烏蘭察布職業(yè)學(xué)院新校區(qū)生物技術(shù)系，內(nèi)蒙古烏蘭察布012000）

新城疫（Newcastle disease，ND）是由新城疫病毒（NDV）引起的以感染禽類為主的一種急性、高度接觸性傳染病，是威脅養(yǎng)禽業(yè)的主要疾病之一［1-2］。新城疫呈世界性流行，各國都十分重視該病，經(jīng)過幾十年的努力，世界各國基本將該病控制住，但從近些年的調(diào)查研究中可以看到，我國的新城疫大規(guī)模流行已得到基本控制，但新城疫仍未從根本上杜絕，在部分地區(qū)仍時(shí)常散發(fā)，而且癥狀與病變呈非典型性［3］，有的病程呈慢性經(jīng)過，給養(yǎng)殖業(yè)帶來很大損失［4］，分析其可能原因之一是與強(qiáng)毒不斷從外界引入有關(guān)。已有研究表明，許多禽類如鴿［5］、麻雀［6］等對(duì)NDV也有易感性，可以作為保毒宿主甚至作為傳染源，它們?cè)谝欢ǚ秶鷥?nèi)的活動(dòng)可以將疫區(qū)的NDV強(qiáng)毒引入雞群，使雞場不斷受到野外強(qiáng)毒威脅。我國是一個(gè)養(yǎng)雞大國，養(yǎng)雞在農(nóng)村甚為普遍，是農(nóng)民一項(xiàng)重要經(jīng)濟(jì)來源，但是由于交通、技術(shù)等原因，長期以來這些地區(qū)成為免疫薄弱區(qū)，特別在偏遠(yuǎn)村落，往往不按合理的免疫程序和免疫方法操作，甚至不用疫苗免疫接種，這樣的雞群一旦侵入強(qiáng)毒則呈典型暴發(fā)，造成極大的損失［7］。因此，本研究的目的就是了解近年來內(nèi)蒙古烏蘭察布地區(qū)新城疫的流行現(xiàn)狀，研究流行毒株的常規(guī)生物學(xué)特性，分析該病的流行趨勢(shì)，為新城疫有效診斷和控制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料 病料采自內(nèi)蒙古集寧地區(qū)2個(gè)養(yǎng)雞場中病死雞的肝臟、肺臟、脾臟、腎臟等組織。

1.1.2 參考毒株及陽性血清 NDV標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)毒株F48E9和弱毒株La Sota，由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院預(yù)防獸醫(yī)學(xué)教研室傳染病組保存；NDV陽性血清和禽流感病毒（AIV）陽性血清（H5N1），由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院預(yù)防獸醫(yī)學(xué)教研室傳染病組提供。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF種蛋由天津瑞普生物制藥廠提供，9日齡～10日齡SPF雞胚，用SPF種蛋在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)用消毒好的孵化器孵化。1日齡SPF雛雞，用SPF種蛋在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)用消毒好的孵化器孵化分組飼養(yǎng)于消毒的動(dòng)物房內(nèi)。6周齡雞，用SPF種蛋在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)用消毒好的孵化器孵化，非新城疫疫苗免疫，分組飼養(yǎng)于消毒的動(dòng)物房內(nèi)。健康馬、牛、羊、雞、兔紅細(xì)胞由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物院提供。人O型新鮮血液由內(nèi)蒙古中心血站提供。

1.2 方法

1.2.1 病料的處理 分別取不同雞場病死雞的腦組織放入消毒好的試管中，用吸管或玻璃棒研磨后加入滅菌生理鹽水配成1∶10組織混懸液，經(jīng)過3次凍融，離心10min（2 000r／min～3 000r／min），之后取上清液加青霉素、鏈霉素使其濃度為1 000單位／mL，4℃過夜后置-20℃保存。

1.2.2 雞胚接種傳代 取9日齡～11日齡SPF雞胚，用1mL注射器吸取處理好的病料接種9日齡～11日齡SPF雞胚（0.1mL／枚），用石蠟封閉接種孔。同時(shí)以3枚雞胚接種0.1mL／枚滅菌生理鹽水作對(duì)照，然后于37℃的恒溫箱內(nèi)孵育，將24h內(nèi)的死胚棄去，24h～96h的死胚及96h存活胚置4℃過夜后觀察雞胚病變，同時(shí)無菌采集尿囊液，-20℃保存。

1.2.3 血凝和血凝抑制試驗(yàn) 按常規(guī)微量法（25μL）［4］測(cè)定無菌收集尿囊液的血凝價(jià)，再用 NDV陽性血清和AIV陽性血清進(jìn)行血凝抑制試驗(yàn)。

1.2.4 血清中和試驗(yàn) 將2個(gè)分離株第3代的雞胚尿囊液分別用滅菌生理鹽水稀釋1 000倍，各取1 mL病毒稀釋液分別與等量10倍稀釋的新城疫標(biāo)準(zhǔn)陽性血清和AIV標(biāo)準(zhǔn)陽性血清充分混均后于37℃作用1h，同時(shí)設(shè)置上述滅菌生理鹽水稀釋1 000倍尿囊液作為對(duì)照組，每組接種10日齡雞胚5只，每胚0.1mL，37℃孵育，接種后每天照蛋2次～4次，死胚隨時(shí)拿出，連續(xù)照蛋7d，活胚置于4℃冰箱凍死測(cè)定所有雞胚尿囊液的血凝價(jià)。

1.2.5 紅細(xì)胞凝集譜的測(cè)定 分別取雞、牛、羊、兔、馬及人O型新鮮血液配置成10mL／L的紅細(xì)胞，對(duì)不同雞場分離的NDV毒株和弱毒株La Sota尿囊液做血凝試驗(yàn)，測(cè)定各毒株對(duì)不同動(dòng)物紅細(xì)胞的凝集力。

1.2.6 毒株毒力測(cè)定

1.2.6.1 致死雞胚平均死亡時(shí)間（MDT）的測(cè)定

JN1和JN2株NDV雞胚尿囊液用無菌生理鹽水（含青霉素和鏈霉素）按10倍系列稀釋，每個(gè)稀釋度分別接種10日齡的SPF 8枚（0.1mL／枚）。37℃孵化，棄去24h內(nèi)死胚，每天照蛋4次，連續(xù)觀察7 d。同時(shí)設(shè)滅菌生理鹽水接種作正常對(duì)照。觀察雞胚死亡情況，剖檢死亡雞胚，最后按公式計(jì)算出致死雞胚平均死亡時(shí)間（MDT）［8］。

1.2.6.2 對(duì)1日齡易感雛雞腦內(nèi)接種致病指數(shù)（ICPI）的測(cè)定 參照文獻(xiàn)［9］，JN1和JN2株 NDV的雞胚尿囊液用無菌生理鹽水進(jìn)行10-1稀釋，給10只出殼后36h內(nèi)的雛雞進(jìn)行腦內(nèi)接種，同時(shí)以6只雛雞腦內(nèi)接種無菌生理鹽水（含青霉素和鏈霉素）作對(duì)照，0.05mL／只，隔離飼養(yǎng)。每隔24h觀察并記錄雞群的情況，進(jìn)行評(píng)定，死雞按2分記，發(fā)病雞按1分記，正常雞按0分記，連續(xù)進(jìn)行8d觀察。最后按公式求出ICPI。

1.2.6.3 對(duì)6周齡非免疫雛雞靜脈接種致病指數(shù)（IVPI）的測(cè)定 JN1和JN2株NDV雞胚尿囊液用滅菌生理鹽水作10-1稀釋，每個(gè)毒株分別給10只6周齡非免疫雛雞（0.1mL／只）翅靜脈接種，并取4只，每只接種0.1mL滅菌生理鹽水，作為正常對(duì)照組，隔離飼養(yǎng)。接種后，每隔24h對(duì)雞群健康情況進(jìn)行檢查，連續(xù)觀察10d，根據(jù)每日雞群的健康情況記分，正常雞只按0分記，發(fā)病雞只按1分記，麻痹雞只按2分記，死亡雞只按3分記，設(shè)置對(duì)照雞5只。按公式計(jì)算IVPI。

2 結(jié)果

2.1 毒株的分離和血凝試驗(yàn)結(jié)果

病料接種雞胚后雞胚大多在26h～78h死亡，死亡雞胚尿囊液較清亮，全身都有出血現(xiàn)象，頭、頸、腹部以及爪最嚴(yán)重，HA滴度為1∶16～1∶528。初代培養(yǎng)物盲傳2代后雞胚死亡時(shí)間逐漸規(guī)律，血凝價(jià)上升2個(gè)滴度。分離株分別命名為JN1和JN2。分離株接種雞胚后雞胚死亡情況及HA測(cè)定結(jié)果如表1。

表1 分離株接種雞胚后雞胚死亡情況及HA測(cè)定結(jié)果Table 1 The chicken embryo death and HA assay results of isolates after inoculation

2.2 血凝抑制試驗(yàn)結(jié)果

分離株尿囊液均可凝集SPF雞的紅細(xì)胞，初代培養(yǎng)物HA滴度為1∶16～1∶528，盲傳2代后，血凝價(jià)可上升2個(gè)滴度。HA價(jià)在1∶32～1∶1 024，2個(gè)分離株可被NDV標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)毒株陽性血清所抑制，不被AIV陽性血清所抑制，分離株HI試驗(yàn)結(jié)果如表2。

2.3 血清中和試驗(yàn)結(jié)果

接種NDV標(biāo)準(zhǔn)陽性血清中和組的雞胚全部健活，且雞胚尿囊液無血凝性，而AIV陽性血清中和組和生理鹽水稀釋的1 000倍尿囊液作為對(duì)照組接種的雞胚全部死亡，其死亡雞胚尿囊液均有血凝性。

2.4 紅細(xì)胞凝集譜的測(cè)定結(jié)果

分離毒株對(duì)不同動(dòng)物紅細(xì)胞的凝集作用不一樣，兩個(gè)分離毒株對(duì)馬、牛、羊、兔紅細(xì)胞的凝集價(jià)較低，而對(duì)雞及人O型紅細(xì)胞的凝集價(jià)較高。分離毒株對(duì)不同動(dòng)物紅細(xì)胞的凝集譜測(cè)定結(jié)果見表3。

2.5 分離毒株毒力測(cè)定結(jié)果

2.5.1 MDT測(cè)定的結(jié)果 2株NDV全部致死雞胚的最高稀釋度分別為10-7和10-7。對(duì)雞胚進(jìn)行觀察，死亡雞胚全身有明顯的出血，其中頭及四肢較嚴(yán)重，未死亡的雞胚部分有出血現(xiàn)象，但不太明顯。對(duì)照組8只雞胚都正常。JN1和JN2的MDT結(jié)果分別為40.5h和43.5h。

2.5.2 ICPI測(cè)定結(jié)果 2株毒株接種后雛雞表現(xiàn)的癥狀相似，主要為食欲下降，嗜睡，翅垂地，后期出現(xiàn)廢食，跛行，一肢或兩肢麻痹癱瘓，呼吸困難，甩頭扭脖子，2d～3d后出現(xiàn)死亡，剖檢后直腸后端有大量的水樣糞便及白色尿酸鹽，有的出現(xiàn)腺胃潰瘍，肺水腫，腦內(nèi)化膿，并有少量的炎性滲出物。JN1和JN2的ICPI結(jié)果分別為1.86和1.85。

2.5.3 IVPI測(cè)定結(jié)果 2株毒株接種后癥狀表現(xiàn)相似，主要為精神萎頓，打堆，嗜睡，有的咳嗽，氣喘，糞便稀軟發(fā)白，食欲減退，耷拉翅膀，部分有轉(zhuǎn)圈運(yùn)動(dòng)，后期表現(xiàn)食欲廢絕，雞冠和肉髯發(fā)紫，張口呼吸，發(fā)出“呼?！甭?，有扭頭動(dòng)作，部分口流黏液。2d～3 d出現(xiàn)死亡，剖檢可見個(gè)別膽囊充盈，脾臟有白色小點(diǎn)狀壞死灶，腺胃黏膜乳頭常有大小不一的出血點(diǎn)，小腸、大腸的黏膜充血或出血，盲腸扁桃體腫大、出血和壞死，喉頭有出血點(diǎn)等。JN1和JN2的IVPI結(jié)果分別為2.38和2.69。

表2 分離株HI試驗(yàn)結(jié)果Table 2 HI test results of isolates strains

表3 分離毒株紅細(xì)胞凝集譜Table 3 The erythrocyte agglutination spectrum of isolate strains

3 討論

從發(fā)病地區(qū)毒株的分離和血凝試驗(yàn)結(jié)果上看，分離株JN1和JN2尿囊液均可凝集SPF雞的紅細(xì)胞，初代培養(yǎng)物HA滴度為1∶16～1∶528。盲傳2代后，血凝價(jià)可上升2個(gè)滴度。HA價(jià)在1∶32～1∶1 024。2個(gè)分離株可被NDV標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)毒株陽性血清所抑制，不被AIV陽性血清所抑制。接種NDV標(biāo)準(zhǔn)陽性血清中和組的雞胚全部健活，且雞胚尿囊液無血凝性，而AIV陽性血清中和組和生理鹽水稀釋的1 000倍尿囊液作為對(duì)照組接種的雞胚全部死亡，其死亡雞胚尿囊液均有血凝性。說明分離的病毒為新城疫病毒而且感染雞胚血凝價(jià)很高。分離毒株對(duì)不同動(dòng)物紅細(xì)胞的凝集作用不一樣，2個(gè)分離毒株對(duì)馬、牛、羊、兔紅細(xì)胞的凝集價(jià)較低，而對(duì)雞及人O型紅細(xì)胞的凝集價(jià)較高。這與孫靜等［10］結(jié)果一樣。薛俊龍［11］報(bào)道新城疫病毒一般對(duì)馬和豬的紅細(xì)胞不凝集，但有個(gè)別弱毒株可以凝集馬的紅細(xì)胞。

有資料報(bào)道，衡量NDV毒力強(qiáng)弱的常用方法是進(jìn)行新城疫病毒的MDT、ICPI和IVPI的測(cè)定。一般認(rèn)為強(qiáng)毒株的MDT＜60h，ICPI＞1.5；中等毒力毒株的 MDT為60h～90h，ICPI為0.6～1.5；弱毒株的 MDT＞90h，IVPI＜0.6。IVPI作為參考，強(qiáng)毒株的IVPI常大于2.0［12］。將我們分離的毒株測(cè)得的ICPI、MDT結(jié)果與之進(jìn)行比較，證明該分離毒株JN1、JN2屬NDV強(qiáng)毒型。

在高強(qiáng)度的免疫壓力下新城疫得到了較好的控制，但近些年來，新城疫出現(xiàn)了一些新的情況，在免疫過的雞群中即使能產(chǎn)生高的抗體滴度，新城疫仍時(shí)有暴發(fā)，已成為威脅家禽養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展最嚴(yán)重的疾病之一［13］。按照傳統(tǒng)經(jīng)驗(yàn)診斷難度大，容易延誤最佳治療時(shí)機(jī)，實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)是確診該病的關(guān)鍵。隨著疫病的流行，養(yǎng)殖戶大量使用抗生素，導(dǎo)致雞群耐藥性增強(qiáng)，傳統(tǒng)疫苗對(duì)流行NDV毒株的預(yù)防效果不斷減弱，因此，研發(fā)新型高效疫苗，制定合理的防控措施，是迫在眉睫的大事。

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