甲醛對小鼠肝臟毒性作用的研究

李亞琳

（渭南師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，陜西渭南714000）

液體腹腔染毒方法能準(zhǔn)確的掌控化學(xué)毒劑的劑量，所以能客觀的估計甲醛劑量與肝臟損傷程度的關(guān)系。因此，本試驗通過小鼠腹腔注射不同濃度的甲醛溶液，觀察小鼠行為變化，測定小鼠肝臟的臟器系數(shù)及肝細(xì)胞的活力，并通過石蠟切片觀察小鼠肝細(xì)胞的病理性變化，探討甲醛對小鼠的肝臟組織及細(xì)胞的毒性作用，為研究甲醛引起的人類疾病提供一定試驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 雄性昆明鼠，2周齡，體重為20 g±2g，購自第四軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心。試驗期間小鼠自由飲水、進食。

1.1.2 試劑 生理鹽水，甲醛溶液，伊紅，蘇木精，臺盼藍染液，700、800、950mL／L乙醇溶液，無水乙醇，福爾馬林溶液，蛋白甘油，鹽酸乙醇，二甲苯，石蠟，中性樹膠。

1.1.3 儀器 超凈工作臺，恒溫水浴箱，電子天平，解剖工具一套，染缸，切片機，恒溫箱，烤片機，光學(xué)顯微鏡，電子顯微成像儀。

1.2 方法

1.2.1 分組 試驗前觀察1周，然后隨機將試驗小鼠分為對照組和3個染毒組，每組9只，染毒組濃度分別為2mg／kg（低）、20.00mg／kg（中）和200.00 mg／kg（高），同時設(shè)置9g／L生理鹽水陰性對照組［4］。

1.2.2 染毒方法 在無菌條件下，染毒組注射不同濃度的甲醛溶液，臨用時配制。采用腹腔注射的方式，每天上午10：00注射一次，每次注射0.1mL。對照組腹腔注射等體積的生理鹽水。持續(xù)注射10d～30d，分別在注射后第10、20、30天每組處死3只小鼠，同時觀察行為變化。

1.2.3 行為觀察 每日觀察并記錄小鼠的食量、飲水量、外觀體征及行為活動等變化。

(4)兼職偏好：學(xué)生兼職會優(yōu)先選擇家教類兼職，其次會選擇服務(wù)類與代理類兼職，這幾類兼職一般收入較高，且能發(fā)揮自身價值。

1.2.4 肝組織的臟器系數(shù) 每只小鼠稱重后脫臼處死并迅速取出肝臟，用電子天平準(zhǔn)確稱量肝臟重量，計算肝臟的臟器系數(shù)。臟器系數(shù)=肝臟質(zhì)量（mg）／體重（g）。

1.2.5 小鼠肝細(xì)胞離體活力檢測 通過臺盼藍染色鑒別死細(xì)胞與活細(xì)胞。臺盼藍排斥法實驗原理：當(dāng)細(xì)胞損傷或死亡時，細(xì)胞膜不再具有選擇透過性，臺盼藍可以穿過變性的細(xì)胞膜，進入細(xì)胞內(nèi)，與細(xì)胞中解體的DNA結(jié)合，使其著色，細(xì)胞變藍。而活細(xì)胞的細(xì)胞膜具有通透性，能阻止臺盼藍染料進入細(xì)胞內(nèi)，細(xì)胞為無色。

1.2.5.1 小鼠細(xì)胞懸液的制備 ①頸椎脫臼法處死小鼠，迅速取出肝臟。

②用冰冷的生理鹽水反復(fù)沖洗，清洗其表面的血跡，再用擦鏡紙包裹肝臟輕微擠壓除去肝臟內(nèi)部的血細(xì)胞，以排除計數(shù)過程中血細(xì)胞的干擾。

③將肝臟置于生理鹽水溶液中，用眼科剪將肝臟剪成糜狀（約1mm3的組織塊），然后加入離心管中。

④將細(xì)胞懸液進行離心（800r／min，5min），取上清液用于細(xì)胞檢測。

1.2.5.2 離體細(xì)胞活力檢測的試驗步驟 用生理鹽水調(diào)整肝細(xì)胞懸液中的細(xì)胞密度到5×105個／mL。取適量肝細(xì)胞懸液加入等體積4g／L臺盼藍溶液，快速用血球計數(shù)板分別計數(shù)活細(xì)胞和死細(xì)胞。并計算細(xì)胞存活率：存活率（%）=活細(xì)胞總數(shù)／（活細(xì)胞總數(shù)＋死細(xì)胞總數(shù)）×100%。

1.2.6 肝組織的形態(tài)及病理學(xué)觀察

1.2.6.1 肝組織的形態(tài)的肉眼觀察 將小鼠脫臼處死，打開腹腔，取出肝臟組織，生理鹽水反復(fù)沖洗后，觀察其形態(tài)、顏色等變化。

1.2.6.2 小鼠肝臟組織石蠟切片的制作 取新鮮肝臟組織，用生理鹽水反復(fù)沖洗后，置于福爾馬林溶液中固定，過夜，常規(guī)脫水石蠟包埋，制作切片，切片厚7μm，蘇木精-伊紅（HE）染色，光學(xué)顯微鏡下觀察組織形態(tài)特征的變化。

1.2.7 統(tǒng)計學(xué)分析 表中數(shù)據(jù)代表3次重復(fù)試驗的平均值（±sD），結(jié)果用成組數(shù)據(jù)平均數(shù)比較的t檢驗分析，有效數(shù)據(jù)定為P＜0.05。

2 結(jié)果

2.1 小鼠行為變化

甲醛對小鼠機體的影響是多方面的。本試驗發(fā)現(xiàn)，甲醛染毒初期，以刺激癥狀為主，表現(xiàn)為抓鼻，抓耳朵，撓嘴；隨染毒時間加長，出現(xiàn)興奮，躁動不安，站立；再后來表現(xiàn)為群聚，少動。整個染毒期間，高濃度組小鼠與對照組小鼠相比，食量減少，飲水量減少。

2.2 小鼠肝組織的臟器系數(shù)

隨著染毒劑量的增加以及染毒時間的延長，小鼠肝臟的臟器系數(shù)逐漸變小。低濃度組與對照組比較無顯著差異，而中、高濃度組與對照組比較差異較顯著（P＜0.05）（圖1A，圖1B）。

2.3 小鼠離體肝細(xì)胞活力檢測

圖1 甲醛處理對小鼠肝臟臟器系數(shù)的影響Fig.1 Effect of formaldehyde on the visceral index of mice liver

隨著染毒劑量的增加以及染毒時間的延長，小鼠離體肝細(xì)胞存活率逐漸變小。與對照組相比，低濃度組具有顯著差異性（P＜0.05），而中、高濃度組差異極顯著（P＜0.01），30天處理組與10天處理組比較也具有顯著性差異（P＜0.05）（圖2A，圖2B）。

圖2 甲醛處理對小鼠離體肝臟細(xì)胞存活率的影響Fig.2 Effect of formaldehyde on the survival rate of hepatocytes in vitro

2.4 小鼠肝臟的病理學(xué)觀察

甲醛染毒后，肉眼觀察，小鼠的肝臟表面變得粗糙，顏色變白，并出現(xiàn)黑色的小點或小斑。隨著甲醛濃度的增大、染毒時間的延長，病變加重。光學(xué)顯鏡下觀察，對照組小鼠肝臟組織細(xì)胞形態(tài)正常，無任何病理變化，而其他染毒組小鼠肝臟組織均在不同程度上變得松散（圖3）。在低濃度組小鼠的肝細(xì)胞中，有少數(shù)的細(xì)胞核裂解，細(xì)胞出現(xiàn)微小形變（圖3B）；中濃度組的小鼠肝臟組織中，可見多數(shù)細(xì)胞核裂解和形變（圖3C）；而高濃度組的小鼠肝臟細(xì)胞中，絕大多數(shù)細(xì)胞核裂解，細(xì)胞明顯形變（圖3D）。

3 討論

3.1 小鼠行為變化

甲醛具有毒性，能對小鼠的行為產(chǎn)生一定的影響，且溶液濃度越高，染毒時間越長，其毒性效應(yīng)越明顯。水迷宮試驗和定位航行試驗均表明，氣態(tài)甲醛可影響小鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力，使其在試驗中錯誤次數(shù)增加，且濃度越高染毒時間越長，其錯誤次數(shù)越多［13-14］。本試驗也說明高濃度和長時期染毒，小鼠的食量、飲水量相對于對照組明顯減少，并且出現(xiàn)懶惰，少動，群聚，糞便不成形，毛發(fā)缺少光澤等現(xiàn)象。

圖3 不同濃度甲醛染毒處理30d后小鼠肝臟組織的病理改變（400×）Fig.3 Mouse liver pathological changes by different formaldehyde concentration treated for 30days（400×）

3.2 小鼠肝組織的臟器系數(shù)

臟器系數(shù)可以直觀、靈敏、有效的反映動物的營養(yǎng)狀態(tài)和臟器受損傷的情況，是一種非特異性指標(biāo)，可綜合地反映有毒物對機體和靶器官的毒性效應(yīng)。臟器系數(shù)的變化?？奢^好地反映化學(xué)毒物對該臟器的毒性綜合情況，也是尋找毒物作用靶器官的重要線索。在排除體重變化對臟器系數(shù)變化影響的情況下，臟器系數(shù)的異常，可證明臟器病理組織學(xué)改變的可能性［15］。

本試驗中，高濃度染毒小組的臟器系數(shù)明顯低于對照組，其差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。說明甲醛可能增加了肝臟的代謝負(fù)荷，也可能間接導(dǎo)致肝臟器官的損壞，使其代謝能力降低，影響了對附加生理或生化負(fù)荷的代償能力。

本研究證明，隨著染毒時間的延長，即使是低濃度的甲醛溶液，也會對小鼠的肝臟產(chǎn)生輕微的毒性作用，引起少數(shù)肝細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的改變，但不會導(dǎo)致明顯的生理病變。在本試驗（連續(xù)注射30d）結(jié)束時，未發(fā)現(xiàn)低濃度的甲醛溶液對小鼠的肝臟產(chǎn)生明顯的病理作用。低劑量甲醛染毒多長時間會導(dǎo)致小鼠肝臟明顯的病理效應(yīng)，需要進一步驗證。

3.3 小鼠離體肝細(xì)胞活力檢測

細(xì)胞活力的檢測對于鑒定細(xì)胞存活情況、細(xì)胞的生理生化活性等具有重要的意義。在本試驗中，離體細(xì)胞的活力檢測不僅可以了解離體肝細(xì)胞的存活情況，還可以檢測不同濃度的甲醛溶液對小鼠肝組織的損傷以及肝細(xì)胞的存活率的影響。與對照組相比，低濃度組的肝細(xì)胞存活率無明顯變化，而中濃度、高濃度組差異性顯著。

3.4 小鼠肝臟的病理學(xué)觀察

肉眼觀察，對照組小鼠肝臟顏色正常，富有光澤，皮下脂肪白而亮，無任何病理性變化。2.00 mg／kg的甲醛溶液對小鼠肝臟的毒性作用不明顯，可能是因為肝臟具有解毒作用，而該濃度的甲醛劑量在小鼠肝臟的解毒范圍之內(nèi)，尚未引起顯著的毒性效應(yīng)就被排出體外，故低濃度組與對照組小鼠的肝臟無明顯差異。而中濃度組、高濃度組小鼠的肝臟出現(xiàn)了明顯的病理變化，肝臟顏色發(fā)暗，無光澤，其表面有黑色的小點或小斑。光鏡下觀察，對照組小鼠肝組織細(xì)胞無異常變化。隨著甲醛染毒濃度的增高以及時間的延長，肝臟病理損傷程度也隨之增加，細(xì)胞從開始的水腫、變性到后來的細(xì)胞核分裂繼而壞死。低濃度組小鼠肝臟損傷較輕，與對照組相比，鏡下未見明顯異常改變。以前有研究表明，高濃度甲醛染毒導(dǎo)致小鼠肝組織細(xì)胞濁腫，匯管區(qū)慢性炎細(xì)胞浸潤，肝細(xì)胞胞漿疏松化，少數(shù)肝細(xì)胞有氣球樣變性，點灶狀壞死，大多數(shù)肝細(xì)胞核裂解，呈現(xiàn)大量病理性核分裂像，細(xì)胞變形顯著［16］。本試驗中，在光鏡下可見中、高濃度組小鼠肝細(xì)胞病理性核分裂明顯，細(xì)胞明顯變形，與前人研究結(jié)果一致。張武全等認(rèn)為脂質(zhì)過氧化物的產(chǎn)生可能是甲醛導(dǎo)致肝臟損傷的機制之一，甲醛可能通過脂質(zhì)過氧化而引起細(xì)胞膜和其他膜結(jié)構(gòu)的破壞，導(dǎo)致膜受體、膜免疫功能失常，最終導(dǎo)致肝臟損傷［17］。

綜上所述，隨著甲醛染毒時間的延長和染毒劑量的增加，其對小鼠肝臟組織的損傷越嚴(yán)重，小鼠肝臟的臟器系數(shù)越低，肝細(xì)胞離體存活率也降低，肝臟組織病理性變化越明顯。本試驗為進一步研究甲醛對人體組織的病理性傷害提供了一定的試驗基礎(chǔ)。

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