豬繁殖與呼吸綜合征病毒雙重熒光RT-PCR 檢測方法的建立

張靖飛，張 園，李志輝，王慧煜，曹達江，梅 琳＊

（1.西安市動物疫病預防控制中心，陜西西安710061；2.山西農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，山西太谷030800；3.中國檢驗檢疫科學研究院，北京100029；4.天杰仁和生物科技（北京）有限公司，北京100029）

豬繁殖與呼吸綜合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome PRRS）又稱“豬藍耳病”，是由豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）引起的以成年豬繁殖障礙、早產(chǎn)、流產(chǎn)和死胎，以及仔豬呼吸異常為特征的傳染病，是一種免疫抑制性疫病，常常繼發(fā)其他病原感染。1987年在北美首次發(fā)現(xiàn)該?。?］，目前世界上許多國家和地區(qū)都發(fā)生過豬繁殖與呼吸綜合征，該病于20世紀90年代中期傳入我國。世界動物衛(wèi)生組織（OIE）將其列為必須報告的動物疫病。

高致病性豬繁殖與呼吸綜合征是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒變異株引起的一種急性高致死性傳染病，我國于2006年發(fā)現(xiàn)［2］。仔豬發(fā)病率可達100%、病死率可達50%以上，母豬流產(chǎn)率可達30%以上，育肥豬也可發(fā)病死亡是其特征。

豬繁殖與呼吸綜合征病毒為單股正鏈RNA病毒，國外的研究表明，同一基因型的PRRSV分離毒株之間存在明顯的序列差異，特別是在基因組ORF1a的NSP1b和NSP2，ORF3和ORF5的變異性很大［3］。我國已發(fā)現(xiàn)NSP2的變異主要表現(xiàn)在氨基酸的缺失，而目前發(fā)現(xiàn)的高致病性豬藍耳病就是由NSP2缺失30個氨基酸的變異株引起的［4-10］。本文根據(jù)GenBank上已經(jīng)公布的國內(nèi)部分高致病性PRRSV NSP2區(qū)的特點設計引物探針，結合PRRSV通用引物探針，建立一種雙重熒光RT-PCR的方法，進行PRRSV普通株（以下簡稱PRRSV）和高致病性株（以下簡稱HP-PRRSV）的檢測。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞毒 包括高致病性毒株（編號為BJ-4，L11304）和普通株（編號為DX，GZ），毒株均由天津大學黃金海教授惠贈。

1.1.2 病豬樣本 共計32份樣本。其中24份由天津大學提供，于2010年5月采集自天津薊縣，8份由西安市動物疫病預防控制中心提供，采集自陜西，具體采集時間、地點不詳。

1.1.3 其他材料 RNA提取試劑盒QIAamp Viral RNA Mini Kit，QIAGEN公司產(chǎn)品；熒光PCR試劑盒One-step qPCR Kit RNA-directTMReal-time PCR Master Mix，TOYOBO公司產(chǎn)品；IQ5實時熒光定量PCR儀，BIO-RAD公司產(chǎn)品；引物和探針由Invitrogen公司合成。

1.2 方法

1.2.1 引物設計 根據(jù)HM853673.1；HM232831.1；HM231830.1；FJ495082.2；HM002808.1；GU169411.1；GQ499194.1l利用引物設探針計軟件Beacon Desig-ner 7.9進行高致病性株引物探針設計，PRRSVNSP2-F： 5′-ACGTGTCCCCAAGCTGATG-3′，PRRSV-NSP2-R： 5′-GCAGACAAATCCAGAGGCTCAT-3′，以 及 PRRSV-NSP2-Probe：5′-FAMTTCCTGCACCGCGTAGAACTGTGACA-TAMRA-3′。 通 用 PRRSV-F：5′-TGATGGGCTGGCATTCTT-3′，PRRSV-R：5′-ACACGGTCGCCCTAATTG-3′ PRRSV-P：5′-FAM-TGTGGTGAATGGCACTGATTGACA-TAMRA-3′

1.2.2 病毒RNA提取 利用病毒核酸試劑盒進行RNA提取，最后用40μL Elution buffer洗脫病毒RNA，存入-70℃冰箱備用。

1.2.3 實時熒光RT-PCR 利用2份高致病性株和2份普通株進行熒光RT-PCR，通過不斷的摸索和條件的調整，最后確定為如下體系和PCR程序：在200μL離心管中加入2×Master Mix 12.5μL，Mn（OAc）21.25μL，引物（10μmol／L）各0.75μL，探針（10μmol／L）各0.5μL，H2O 4.25μL，RNA 1 μL，總體積25μL。設置熒光通道分別為FAM，HEX。PCR程序為：90℃30s，61℃ 20min，95℃30s，逆轉錄，然后95℃15s，52℃45s，40個循環(huán)，其中54℃45s進行熒光信號收集。

1.2.4 特異性試驗 用PRRSV普通株2株，PRRSV高致病性株2株以及其他動物病毒，包括豬瘟病毒，豬流感病毒，口蹄疫病毒以及ddH2O做熒光RT-PCR。在200μL離心管中加入2×Master Mix 12.5μL Mn（OAc）21.25μL引物（10μmol／L）各0.75μL，探針（10μmol／L）各0.5μL，H2O 4.25 μL，RNA 2μL，總體積25μL。設置熒光通道分別為FAM，HEX，PCR 程序為：90℃ 30s，61℃ 20 min，95℃30s逆轉錄，然后95℃15s，52℃45s，40個循環(huán)，其中54℃45s進行熒光信號收集。

1.2.5 靈敏度試驗 將產(chǎn)物進行回收、連接、轉化、單克隆培養(yǎng)、質粒提取，制備陽性對照。測定質粒濃度，將質粒進行稀釋，調整拷貝數(shù)為1～107進行熒光PCR，檢測最低檢測量，反應體系為2×Master Mix 12.5μL，Mn（OAc）21.25μL，引 物 （10 μmol／L）各0.75μL，探針（10μmol／L）各0.5μL，H2O 7.75μL，質粒1μL，總體積25μL。PCR程序為：95℃2min，95℃15s，52℃45s，40個循環(huán)，其中54℃45s進行熒光信號收集。

1.2.6 臨床樣本檢測 將收集到的32份樣本用本研究建立的方法進行檢測。陽性結果測序，做進一步確認。

2 結果

2.1 熒光PCR試驗結果

用2份高致病性和2份普通樣本核酸進行熒光PCR，結果顯示FAM熒光通道4份樣本全部為陽性，HEX通道只有兩份，即高致病性株為陽性（圖1），從而證明該方法可以檢測出并且區(qū)分出豬藍耳病高致病性株和普通株。

圖1 實時熒光定量PCR曲線Fig.1 Real-time PCR curve

2.2 特異性試驗結果

從結果中可以看出，HEX通道檢測到4份陽性，HEX通道檢測到2份陽性，其余全部為陰性（圖2）。

圖2 特異性試驗結果Fig.2 Specificity of real-time RT-PCR

結果中可以得出該方法可以特異的檢測豬繁殖與呼吸綜合征病毒，并且可以區(qū)分高致病株和普通株。

2.3 靈敏度試驗結果

將質粒稀釋成1～107拷貝，進行擴增，得到的標準曲線如圖3，擴增效率均＞99%，R2＞0.99。從結果中可以看出FAM通道可以檢測出的最低拷貝數(shù)為10，HEX通道結合熒光峰圖和標準曲線，認為可以準確檢測到的拷貝數(shù)為102。可以得出反應體系和反應條件可以滿足相關基因的擴增效率，可滿足樣品的檢測需要。

圖3 普通PRRSV和高致病性PRRSV標準曲線Fig.3 PRRSV and HP-PRRSV curves

2.4 樣本檢測結果

總共32份樣本中，根據(jù)靈敏度試驗結果，我們確定取Ct≤35為陽性。經(jīng)過檢測，32份樣標本中豬繁殖與呼吸綜合征高致病性株為19份，普通株為9份，陰性為4份。將所有陽性樣本進行測序驗證，確定檢測結果完全正確（圖4）。

圖4 部分標本檢測結果Fig.4 The test results of part samples

3 討論

這繁殖與呼吸綜合征目前是阻礙我國養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展的一種重要病毒性疾病，尤其是2006年高致病性PRRSV發(fā)現(xiàn)之后，對其檢測和預防工作也在一步步加強，就我國發(fā)現(xiàn)的高致病性PRRSV而言，在基因水平上NSP2基因缺失了30個氨基酸。所以，對于PRRSV普通株和高致病性株的區(qū)分必須從這個基因缺失的區(qū)段進行，根據(jù)這一區(qū)段進行引物探針的設計，從而將兩者區(qū)分。

本研究中，通過對32份臨床樣本檢測，通用陽性率為87.5%，高致病性株陽性率為59.38%。經(jīng)過測序證明了檢測的準確性。由于所采用的臨床標本來自兩個不同的地區(qū)，所以可以確定本方法可以特異的檢測出PRRSV以及區(qū)分普通株和高致病性株。在靈敏度試驗中，該方法檢測出質粒的最低濃度在PRRSV可以達到102拷貝，HP-PRRSV可以達到10拷貝，證明了方法有較高的靈敏度，可以滿足臨床檢測的需求。

對于PRRSV的檢測目前應用最多的是基于抗原抗體反應的ELASE［11-12］，其次使用最多的是RTPCR［13-14］以及實時熒光定量PCR［15］，但是這些方法都有其局限性，ELASE其優(yōu)勢在于可以快速檢測，但是目前還不能區(qū)分高致病性株和普通株，而且靈敏度較低。RT-PCR法可以對高致病性株和普通株進行區(qū)分，靈敏度介于ELASE和熒光PCR之間，所以可能因為病毒載量的問題而出現(xiàn)假陰性，造成漏檢。實時熒光定量PCR的缺點就在于其只能單一檢測出高致病株或者是所有的病毒株，不能一次性區(qū)分開。而本研究所建立的方法，靈敏度高，特異性強，同時可以完全區(qū)分開高致病性株和普通株，從而縮短了鑒別檢測時間，具有較高應用價值。

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