細(xì)粒棘球絳蟲G1型Eg95基因的原核表達(dá)及蛋白鑒定

徐 丹，曹利利，魏 峰，楊美英，張瑩光，商立民，劉 全＊

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，吉林長(zhǎng)春130118；2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院軍事獸醫(yī)研究所 吉林省人獸共患病預(yù)防與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林長(zhǎng)春130122；3.吉林省畜牧獸醫(yī)科學(xué)研究院，吉林長(zhǎng)春130062）

棘球蚴病（Echinococcosis）又稱包蟲?。℉ydatid disease），是由棘球?qū)俳{蟲的幼蟲寄生于人或動(dòng)物引起的呈世界分布的人獸共患寄生蟲病［1］。豬、牛等中間宿主因誤食蟲卵污染的水或食物而感染，蟲卵經(jīng)胃液消化，在小腸內(nèi)孵化為六鉤蚴并沿血液循環(huán)通路進(jìn)入肝、肺、腦等組織，導(dǎo)致牲畜體質(zhì)下降，繁殖能力喪失，最后大批死亡，嚴(yán)重危害畜牧業(yè)發(fā)展［2］。目前公認(rèn)的棘球?qū)俳{蟲有4個(gè)種，即細(xì)粒棘球絳蟲（Echinococcus granulosus）、多房棘球絳蟲（E.multilocularis）、少節(jié)棘球絳蟲 （E.oligarthrus）和褔氏棘球絳蟲（E.vogeli），我國(guó)存在前2種，其中主要是細(xì)粒棘球絳蟲［3］。根據(jù)細(xì)粒棘球絳蟲細(xì)胞色素C氧化酶亞單位1、NADH脫氫酶1及核糖體DNA第一轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)ITS1基因，將細(xì)粒棘球絳蟲劃分為10個(gè)基因型（G1～G10）［4］。我國(guó)已發(fā)現(xiàn)細(xì)粒棘球絳蟲G1型（羊株）及G6型（駱駝株）［5］，其中 G1型為流行株［6］。

細(xì)粒棘球絳蟲Eg95蛋白在細(xì)粒棘球絳蟲六鉤蚴時(shí)期入侵小腸絨毛上皮過(guò)程中起重要作用。有研究表明，接種細(xì)粒棘球蚴Eg95重組抗原疫苗的羊可獲得96%～100%的免疫保護(hù)，其中86%的羊得到完全的保護(hù)［7］，Eg95抗原被認(rèn)為是理想的保護(hù)性抗原。但不同種細(xì)粒棘球絳蟲發(fā)育速度、宿主范圍、致病性等存在較大差異［4］，不同地域及不同宿主的Eg95基因之間也存在著差異［8］，故應(yīng)對(duì)不同種細(xì)粒棘球絳蟲作針對(duì)性研究。

本研究以我國(guó)高發(fā)的細(xì)粒棘球絳蟲G1型Eg95基因開放閱讀框?yàn)檠芯繉?duì)象，表達(dá)了細(xì)粒棘球絳蟲Eg95蛋白，并對(duì)表達(dá)蛋白進(jìn)行 Western blot鑒定，以期為我國(guó)細(xì)粒棘球絳蟲病診斷防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 模板及血清 細(xì)粒棘球絳蟲G1型Eg95抗原基因序列由上海旭冠生物科技發(fā)展有限公司合成，細(xì)粒棘球絳蟲感染羊陽(yáng)性血清由青海省動(dòng)物疾病預(yù)防控制中心饋贈(zèng)。

1.1.2 質(zhì)粒與菌種 原核表達(dá)載體pET-28a、大腸埃希菌 DH5α、BL21（DE3）均由本實(shí)驗(yàn)室保存。pMD-18T載體購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司。

1.1.3 酶與試劑 10×PCR buffer、MgCl2、dNTPs、Taq DNA聚合酶、T4DNA連接酶均購(gòu)自Promega公司；6×Loading buffer、DNA Marker DL 2 000、DNA Marker DL10 000，購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司；DNA快速純化／回收試劑盒、質(zhì)?？焖偬崛≡噭┖?，購(gòu)自北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限公司；IPTG篩選試劑，購(gòu)自北京博潤(rùn)德生物科技發(fā)展中心；EcoRⅠ、XhoⅠ限制性內(nèi)切酶、預(yù)染蛋白Marker，購(gòu)自NEB公司；辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG（H＋L），購(gòu)自ZSGB-BIO公司；DAB顯色試劑盒，購(gòu)自MAIXIN-Bio公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.4 引物的設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)G1型細(xì)粒棘球絳蟲Eg95抗原基因，利用Oligo軟件設(shè)計(jì)了一對(duì)特異性引物，為使抗原基因正確克隆到pET-28a載體，上游引物加入EcoRⅠ酶切位點(diǎn)，下游引物加入XhoⅠ酶切位點(diǎn)，引物由北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限公司合成。

引物 序 列 如 下：F1：5′-CCGGAATTCGCATTCCAGTTATGTCGCATC-3′；R1：5′-CGCTCGAGAGTAAGGACAACCACTATGC-3′。

1.2 方法

1.2.1 PCR擴(kuò)增Eg95基因 以合成的Eg95基因序列為模板，F(xiàn)1和R1為引物擴(kuò)增Eg95基因，反應(yīng)體系如下：反應(yīng)總體積25μL，其中10×PCR buffer 2.5μL，MgCl2（2.5mmol／L）2.5μL，dNTPs（10 mmol／L）0.6μL，F(xiàn)1（10μmol／L），R1（10μmol／L）各1μL，Taq DNA聚合酶（2.5U／μL）0.25μL，模板DNA 1μL，ddH2O 16.15μL。擴(kuò)增條件為：94℃預(yù)變性3min；94℃60s，58℃30s，72℃60s，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸5min。PCR產(chǎn)物經(jīng)10g／L瓊脂糖凝膠電泳觀察結(jié)果。

1.2.2 pET-28a-Eg95原核表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定利用DNA快速純化／回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物，將純化的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與pMD-18T載體連接，16℃連接過(guò)夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含有氨芐青霉素（50μg／mL）的LB瓊脂培養(yǎng)基上，37℃過(guò)夜培養(yǎng)，挑取單克隆培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切鑒定重組子。將鑒定正確的重組質(zhì)粒和pET-28a載體分別用EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切，回收抗原基因及載體片段，回收產(chǎn)物用T4DNA連接酶16℃連接過(guò)夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞，在含卡那霉素（50μg／mL）的LB瓊脂培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)12 h，挑取單菌落培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，用EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切鑒定，酶切產(chǎn)物經(jīng)10g／L瓊脂糖凝膠電泳觀察結(jié)果。鑒定正確的pET-28a-Eg95質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coli BL21感受態(tài)細(xì)胞。

1.2.3 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá) 取單克隆陽(yáng)性菌落pET-28a-Eg95質(zhì)粒的BL21菌種，1%接種于含50 μg／mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)至OD 600nm為0.4～0.6時(shí)，加入無(wú)菌IPTG至終濃度為1mmol／L，誘導(dǎo)表達(dá)4h后，表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE分析，同時(shí)用終濃度為1mmol／L的IPTG誘導(dǎo)含空載體pET-28a的BL21（DE3）。

1.2.4 表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE檢測(cè) 收集表達(dá)及對(duì)照組菌液，重懸于SDS-PAGE上樣緩沖液中，煮沸變性5min，11 000r／min離心5min后電泳（130 g／L SDS-PAGE）。電泳后考馬斯亮藍(lán)R-250染色過(guò)夜，脫色液脫色至背景透明。

1.2.5 Western blot分析 表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDSPAGE電泳后，電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜（NC膜）上（電壓15V，30min），50g／L脫脂奶粉的PBS為封閉液封閉膜上的非特異性位點(diǎn)，室溫孵育2h，用PBST（含體積比0.5mL／L Tween-20的PBS）漂洗5次，每次5min，膜上加入用封閉液以1∶1 500倍稀釋的陽(yáng)性血清，4℃孵育過(guò)夜，用PBST漂洗5次，加入用PBS以1∶3 000倍稀釋的二抗（辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG）室溫孵育2h，用PBST漂洗5次，DAB顯色液顯色。

2 結(jié)果

2.1 PCR擴(kuò)增Eg95基因的結(jié)果

以合成Eg95基因?yàn)槟０澹?jīng)PCR擴(kuò)增得到一條約480bp的基因片段，其大小與預(yù)期結(jié)果相符合（圖1）。

圖1 Eg95基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物Fig.1 Amplification of EG95gene by PCR

2.2 重組質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定

重組質(zhì)粒pET-28a-Eg95經(jīng)EcoRⅠ、XhoⅠ雙酶切鑒定，可得到480bp和5 400bp左右的條帶，與預(yù)期片段大小相符（圖2），說(shuō)明目的片段已插入到pET-28a載體中。

圖2 重組質(zhì)粒pET-28a-Eg95酶切鑒定Fig.2 Identification of the pET-28a-Eg95by enzyme digestion

2.3 表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE檢測(cè)

結(jié)果顯示，重組融合蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量約為16.5ku，大小與預(yù)期融合蛋白分子質(zhì)量基本一致，對(duì)照無(wú)此條帶（圖3）。

2.4 表達(dá)產(chǎn)物的Western blot分析

表達(dá)蛋白經(jīng)SDS-PAGE后，轉(zhuǎn)移至NC膜上進(jìn)行免疫學(xué)反應(yīng)，結(jié)果顯示（圖4），重組蛋白可以被陽(yáng)性血清識(shí)別，證明重組蛋白具有很好的反應(yīng)原性。

圖3 重組蛋白的SDS-PAGE分析Fig.3 Analysis of the recombinant protein by SDS-PAGE

圖4 重組蛋白的Western blot分析Fig.4 Western blot analysis of the recombinant protein

3 討論

棘球蚴病呈世界性分布，我國(guó)以甘肅、新疆、寧夏、內(nèi)蒙古、青海等?。▍^(qū)）流行嚴(yán)重。世界各國(guó)均投入大量的人力、物力、財(cái)力，通過(guò)各種途徑開展棘球蚴病的防控研究［9］，傳統(tǒng)的利用化學(xué)藥物治療寄生蟲病易使蟲株產(chǎn)生耐藥性，不利于長(zhǎng)期性治療［10］。早期利用重組抗原疫苗防控羊棘球蚴病獲得良好免疫保護(hù)效果，疫苗防控成為控制棘球蚴病流行的有效方法［11］。

EG95是一種具有保護(hù)作用的抗原，為最具發(fā)展前景的棘球蚴病侯選疫苗。Lightowlers M W等［7］研究發(fā)現(xiàn)，用pGEX-3-EX表達(dá)EG95重組蛋白免疫的羊能夠誘導(dǎo)出高水平的保護(hù)作用，約86%的羊得到完全的免疫保護(hù)。丁劍冰等［12］利用構(gòu)建的pcDNA3-EG95核酸疫苗免疫小鼠，可誘發(fā)小鼠產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答。賈海英等［13］對(duì)新西蘭株細(xì)粒棘球絳蟲EG95重組抗原蛋白進(jìn)行血清學(xué)研究，試驗(yàn)結(jié)果表明細(xì)粒棘球絳蟲病病人血清可與EG95重組抗原特異性反應(yīng)，為EG95重組抗原應(yīng)用于臨床提供科學(xué)依據(jù)。

我國(guó)是棘球蚴病高發(fā)的國(guó)家，以G1型細(xì)粒棘球蚴感染最為流行［5-6］，本研究根據(jù)已知的細(xì)粒棘球絳蟲G1型EG95基因開放閱讀框?yàn)檠芯繉?duì)象，利用原核表達(dá)載體pET-28a在大腸埃希菌中高效表達(dá)細(xì)粒棘球絳蟲G1型EG95蛋白，經(jīng)SDS-PAGE后進(jìn)行Western blot分析，檢測(cè)結(jié)果表明，在16.5 ku左右出現(xiàn)一條特異性反應(yīng)條帶，表明G1型細(xì)粒棘球絳蟲EG95蛋白在大腸埃希菌中高效表達(dá)，本研究下一步將對(duì)EG95重組蛋白進(jìn)行純化并鑒定其免疫原性，為疫苗制備奠定基礎(chǔ)，以期為防控我國(guó)細(xì)粒棘球絳蟲病提供有效的途徑。

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