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    皮毛中5種病毒基因芯片檢測(cè)方法的研究

    2013-08-14 08:01:48李苗云馮松凱
    關(guān)鍵詞:基因芯片皮毛探針

    徐 超,李苗云,馮松凱

    (1.河南出入境檢驗(yàn)檢疫局,河南鄭州450003;2.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院,河南鄭州450002)

    在牛、羊等動(dòng)物皮毛中可以攜帶藍(lán)舌病病毒(Bluetongue virus,BTV)、口蹄疫病毒(Foot and mouth disease virus,F(xiàn)MDV)、山羊痘病毒(Goatpox virus,GPV)、綿羊痘病毒(Sheeppox virus,SPPV)、牛病毒性腹瀉病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)等5種病毒。這幾種病毒通過皮毛傳播的風(fēng)險(xiǎn)較高,動(dòng)物感染后,病死率高,并將迅速形成暴發(fā)和流行趨勢(shì),對(duì)家畜和皮毛相關(guān)從業(yè)人員健康造成重大危害。目前,我國(guó)已經(jīng)成為世界上最大的皮毛進(jìn)口國(guó),進(jìn)口皮張來源廣泛,進(jìn)出口批次量大頻繁,急需一種能對(duì)皮毛攜帶病毒高通量、快速篩查的方法。但迄今為止,國(guó)內(nèi)外只有少量對(duì)皮毛攜帶一種或兩種病毒檢測(cè)方法的研究,檢測(cè)方法主要依靠經(jīng)典的血清學(xué)方法和PCR技術(shù)[1-4],已經(jīng)無法適應(yīng)對(duì)進(jìn)口皮毛進(jìn)行快速、大批量篩查檢測(cè)的要求。為此,本研究采用基因芯片技術(shù),根據(jù)BTV、FMDV、GPV、SPPV和BVDV等5種病毒的特異性序列設(shè)計(jì)多條引物和探針,研究同時(shí)檢測(cè)5種病毒的基因芯片檢測(cè)方法。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 毒株 牛病毒性腹瀉病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV),綿羊痘病毒(Sheeppox virus,SPPV),山羊痘病毒(Goatpox virus,GPV)HN-1株,偽狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)HN-3株,豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)HN-2株,禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)HN-1株,新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)HN-5,藍(lán)舌病病毒(Bluetongue virus,BTV)和O型口蹄疫病毒(Foot and mouth disease virus serotype O,F(xiàn)MDV/O),均由河南出入境檢驗(yàn)檢疫局技術(shù)中心微生物實(shí)驗(yàn)室保存。

    1.1.2 主要試劑 MasterMix Taq酶、TIANscript M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶,100bp DNA Marker,TIANprep Mini普通質(zhì)粒小提試劑盒,TIANgel Midi普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒,購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司;DNA Maker DL 1 500和DL 600,購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司;MiniBEST病毒核酸提取試劑盒,pMDTM18-T Vector試劑盒,X-Gal,IPTG,EcoRⅠ酶和HindⅢ酶,購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司;藍(lán)舌病病毒(BTV),口蹄疫病毒(FMDV),山羊痘病毒(GPV),綿羊痘病毒(SPPV),牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)核酸檢測(cè)試劑盒購(gòu)自廣州維伯鑫生物科技有限公司;晶芯○R基因芯片點(diǎn)樣液、光學(xué)級(jí)氨基基片,購(gòu)自博奧(北京)生物有限公司。

    1.1.3 儀器 SmartArrayerTM48芯片點(diǎn)樣儀,BioMixerTMⅡ芯片雜交儀,晶芯SlideWasher芯片洗干儀,晶芯LuxScanIM10K芯片掃描儀,博奧北京生物有限公司生產(chǎn);LabCycler Standard梯度PCR儀,德國(guó)SENSO公司生產(chǎn);BioSpec-nano微量核酸蛋白儀,日本島津公司生產(chǎn);GBOX-HR-E-M型全自動(dòng)凝膠成像分析系統(tǒng),英國(guó)昊維特公司生產(chǎn)。

    1.2 方法

    1.2.1 引物和探針的設(shè)計(jì) 在NCBI上查找BTV、FMDV、GPV、SPPV、BVDV等5種病毒的基因組序列并進(jìn)行序列分析。選擇GenBank登錄號(hào)為 GU954426.1,GU125646.1,EF517961.1,AY077834.1和GU395536.1作為參考序列,使用Prime 5.0軟件分別設(shè)計(jì)5種病毒的多重PCR引物和相應(yīng)的寡核苷酸探針。每種病毒的上游引物5′端標(biāo)記TAMARA熒光基團(tuán)。探針長(zhǎng)度小于35bp的探針5′端加T至35bp。引物和探針的合成、標(biāo)記均由寶生物工程(大連)有限公司完成,具體序列見表1。

    表1 基因芯片檢測(cè)引物和探針序列Table 1 Primers and probe sequences of the gene chip detection

    1.2.2 5種病毒目的基因的克隆和鑒定 參照MiniBEST核酸提取試劑盒說明書提取BTV、FMDV、BVDV、GPV和SPPV病毒核酸,用表1的引物分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增?;厥漳康腜CR產(chǎn)物,TA克隆于pMD18-T質(zhì)粒。挑選陽性重組體,用EcoRⅠ和HindⅢ單、雙酶切鑒定,并進(jìn)行序列測(cè)定。

    1.2.3 基因芯片檢測(cè)方法的建立和優(yōu)化

    1.2.3.1 基因芯片的制備 以晶芯○R基因芯片點(diǎn)樣液稀釋各探針至終濃度為30μmol/L,用Smart-ArrayerTM48芯片點(diǎn)樣儀將各探針陣列點(diǎn)樣于空白基片。每張基片設(shè)12個(gè)矩陣,每個(gè)矩陣為11×11陣列。矩陣布局為:第1行和第1列為點(diǎn)樣質(zhì)控探針,各11個(gè)重復(fù)點(diǎn);第2行和第11行為雜交質(zhì)控探針,各10個(gè)重復(fù)點(diǎn);第10行依次為點(diǎn)樣液和空白對(duì)照,各5個(gè)重復(fù)點(diǎn);第3行前5個(gè)探針點(diǎn)為BTV探針1;第5行前5個(gè)探針點(diǎn)為FMDV探針1;第7行前5個(gè)探針點(diǎn)為GPV探針3,后5個(gè)探針點(diǎn)為SPPV探針3;第8行前5個(gè)探針點(diǎn)為BVDV探針3,其他位置為未檢測(cè)出陽性信號(hào)點(diǎn)樣探針點(diǎn)。點(diǎn)樣完畢,將制備的芯片80℃固定探針2h~3h后,4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.2.3.2 多重PCR方法的建立 分別提取5種病毒核酸,以BTV、FMDV、BVDV病毒核酸為模板,建立三重RT-PCR方法,采用25.0μL反應(yīng)體系。反應(yīng)體系為:逆轉(zhuǎn)錄酶1.0μL,2×TaqPCR MasterMix 12.5μL,上游引物各(20μmol/L)0.5μL,下游引物各(20μmol/L)0.5μL,模板各2.0μL,補(bǔ)水至25.0μL。反應(yīng)條件為:42℃反轉(zhuǎn)錄30min;94℃預(yù)變性5min;94℃1min,55℃1min,72℃1 min,共30個(gè)循環(huán);72℃延伸10min。以GPV、SPPV病毒核酸為模板,建立雙重PCR方法,采用25.0μL反應(yīng)體系,雙重PCR反應(yīng)體系為:2×TaqPCR MasterMix 12.5μL,上游引物(20μmol/L)各0.5μL,下游引物(20μmol/L)各0.5μL,模板各2.0μL,補(bǔ)水至25.0μL。PCR反應(yīng)條件為:94℃預(yù)變性5min;94℃1min,43℃1min,72℃1min,共30個(gè)循環(huán);72℃延伸10min。

    1.2.3.3 基因芯片的雜交與洗滌 取42℃預(yù)熱的含470mL/L甲酰胺的雜交液8μL(1 000mL/L甲酰胺3.75μL、20×SSC 2.25μL、100g/L SDS 0.3 μL、50× Denhardt’s 1.5μL,水0.2μL)與7μL PCR產(chǎn)物混勻,95℃變性10min,迅速冰浴5min。參照晶芯○R基因芯片雜交盒說明,將雜交樣品點(diǎn)加到基因芯片每個(gè)陣列中。在芯片雜交儀中42℃、5 RPM搖轉(zhuǎn)雜交4h。雜交完畢,在芯片清洗儀中使用洗液Ⅰ(2× SSC,20g/L SDS)42℃振蕩洗滌3 min,重復(fù)3次;洗液Ⅱ(0.2×SSC)洗滌3次;超純水清洗2次后,300r/min離心甩干后備檢。

    1.2.3.4 病毒基因芯片掃描與分析 預(yù)熱芯片掃描儀,選擇Cy3通道掃描雜交的基因芯片,Lux-Can3.0軟件記錄、分析熒光信號(hào)強(qiáng)度。

    1.2.3.5 基因芯片雜交液和雜交時(shí)間的優(yōu)化 選擇不同甲酰胺濃度的4種雜交液,參照1.2.3.3方法以病毒PCR產(chǎn)物與制備的基因芯片分別雜交30min、1 h、2h和4h,雜交過夜,掃描、記錄雜交信號(hào),根據(jù)雜交信號(hào)的強(qiáng)度選擇最佳雜交條件。雜交液配方為:雜交液a(配方見1.2.3.3)、雜交液b(3× SSC、2g/L SDS、250g/L甲酰胺、5×Denhardt’s)、雜交液c(5×SSC、25g/L甲酸胺、2g/L SDS)和雜交液d(20×SSC 1.5μL,100g/L SDS 0.25μL)。

    1.2.4 特異性試驗(yàn) MiniBEST病毒核酸提取試劑盒分別提取1.1材料中9種病毒核酸。使用表1中病毒特異性引物參照方法1.2.2對(duì)9種病毒進(jìn)行擴(kuò)增后,PCR產(chǎn)物分別與制備基因芯片雜交,觀察、記錄結(jié)果。

    1.2.5 敏感性試驗(yàn) 用微量核酸蛋白儀分別測(cè)定BTV、FMDV、GPV、SPPV、BVDV等5種病毒重組質(zhì)粒濃度,用超純水做100倍梯度稀釋,共做5個(gè)稀釋度,按照方法1.2.2擴(kuò)增后,與制備的基因芯片雜交,研究基因芯片的敏感性。

    1.2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 以BTV、GPV和BTV、GPV、SPPV三重PCR產(chǎn)物分別與4℃避光1個(gè)月、2個(gè)月、4個(gè)月和6個(gè)月的基因芯片雜交,了解制備的病毒基因芯片的穩(wěn)定性。

    1.2.7 方法對(duì)比試驗(yàn) 選擇151份皮毛樣品,隨機(jī)添加構(gòu)建的5種病毒質(zhì)粒,室溫條件下放置12h~24h,采用酚氯仿法提取皮毛樣品中的核酸,按照

    1.2.3.3 步驟與制備的病毒基因芯片進(jìn)行雜交,同時(shí)用維伯鑫病毒核酸檢測(cè)試劑盒進(jìn)行平行檢測(cè),與病毒基因芯片檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較。

    2 結(jié)果

    2.1 病毒重組質(zhì)??寺『丸b定結(jié)果

    分別提取BTV、FMDV、GPV、SPPV和BVDV等5種病毒核酸,PCR擴(kuò)增后,20g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),電泳條帶大小分別為221、136、256、157、214 bp,結(jié)果和設(shè)計(jì)的擴(kuò)增目的片段大小一致(圖1)。對(duì)陽性克隆質(zhì)粒鑒定發(fā)現(xiàn),EcoRⅠ和HindⅢ單、雙酶切片段大小與設(shè)計(jì)擴(kuò)增片段大小一致。測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)構(gòu)建的BTV、FMDV、GPV、SPPV和BVDV的重組質(zhì)粒與病毒參考序列高度同源,同源性分別為98%、96%、98%、96%、96%,說明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

    圖1 5種病毒PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 PCR amplification results of the 5viruses

    2.2 多重PCR擴(kuò)增結(jié)果

    提取5種病毒陽性克隆質(zhì)粒為模板,進(jìn)行BTV、FMDV、BVDV三重RT-PCR擴(kuò)增,產(chǎn)物大小分別221、136、214bp,與設(shè)計(jì)目的片段大小一致(圖2);建立的GPV、SPPV雙重PCR產(chǎn)物電泳條帶大小分別為256bp、157bp,預(yù)期設(shè)計(jì)電泳條帶大小一致(圖3)。

    2.3 基因芯片方法建立和優(yōu)化

    2.3.1 雜交探針篩選 依據(jù)基因芯片雜交特異性和敏感性試驗(yàn)結(jié)果中各病毒檢測(cè)探針熒光信號(hào)強(qiáng)度,篩選出檢測(cè)5種病毒特異性寡核苷酸探針,BTV探針1、FMDV探針1、GPV探針3、SPPV探針3、BVDV探針3。

    2.3.2 基因芯片雜交條件優(yōu)化 分別選擇4種不同的雜交液和不同的雜交時(shí)間,參照1.2.3.3方法以BTV PCR產(chǎn)物與基因芯片雜交,根據(jù)雜交信號(hào)的強(qiáng)度,結(jié)果發(fā)現(xiàn),選擇雜交液a,在42℃、5RPM條件下雜交4h雜交信號(hào)最強(qiáng)。

    圖2 BTV、FMDV、BVDV三重PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 Triplex PCR amplification results of BTV,F(xiàn)MDV and BVDV

    2.4 方法的特異性試驗(yàn)

    以提取的9種病毒核酸為模板,PCR擴(kuò)增后,每種病毒的擴(kuò)增產(chǎn)物分別與制備基因芯片雜交。發(fā)現(xiàn)擴(kuò)增的BTV、FMDV、GPV、SPPV和BVDV產(chǎn)物在相應(yīng)檢測(cè)探針位點(diǎn)出現(xiàn)綠色熒光信號(hào),擴(kuò)增PRV、PRRS、AIV、NDV的未出現(xiàn)雜交信號(hào)(圖4)。結(jié)果表明,各病毒探針之間無交叉反應(yīng),制備的芯片具有很強(qiáng)的特異性。

    圖3 GPV、SPPV雙重PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.3 Duplex PCR amplification results of GPV and SPPV

    2.5 方法的敏感性試驗(yàn)

    用微量核酸蛋白儀測(cè)定BTV、FMDV、GPV、SPPV和BVDV陽性重組質(zhì)粒濃度。以倍比稀釋的核酸為模板,按照1.2.3.3方法與基因芯片進(jìn)行雜交。結(jié)果表明,病毒基因芯片可檢測(cè)到BTV、FMDV、GPV、SPPV、BVDV陽性雜交信號(hào)核酸最低濃度分別約為20、10、10、10、20拷貝。

    2.6 方法的穩(wěn)定性試驗(yàn)

    與4℃避光保存的病毒基因芯片進(jìn)行雜交,結(jié)果發(fā)現(xiàn)三組病毒PCR產(chǎn)物與至少保存6個(gè)月的病毒基因芯片雜交仍能出現(xiàn)陽性熒光信號(hào)。將陽性雜交芯片在室溫條件下避光保存3個(gè)月,5個(gè)月和6個(gè)月,結(jié)果發(fā)現(xiàn)保存6個(gè)月雜交芯片仍有很強(qiáng)的熒光信號(hào)。

    圖4 病毒基因芯片檢測(cè)特異性結(jié)果Fig.4 Specificity of microarray in detecting viral pathogens

    2.7 方法比對(duì)結(jié)果

    用酚氯仿法從放置24h構(gòu)建的模擬陽性皮毛樣品中提取病毒核酸,按照1.2.3.3方法與制備的基因芯片進(jìn)行雜交后。皮毛樣品2號(hào)芯片檢測(cè)結(jié)果為BTV、FMDV和BVDV陽性,皮毛樣品26號(hào)芯片檢測(cè)結(jié)果為BTV和GPV陽性,皮毛樣品32號(hào)芯片檢測(cè)結(jié)果為FMDV陽性(圖5)。用維伯鑫5種病毒核酸檢測(cè)試劑盒分別對(duì)皮毛樣品2號(hào)、26號(hào)和32號(hào)核酸進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果一致(圖6)。對(duì)151份陽性皮毛樣品檢測(cè)結(jié)果和維伯鑫5種病毒核酸檢測(cè)試劑盒檢測(cè)結(jié)果檢測(cè)符合率為100%。

    圖5 病毒基因芯片檢測(cè)皮毛樣品結(jié)果Fig.5 Results of microarray in detecting fur samples

    圖6 維伯鑫病毒檢測(cè)試劑盒檢測(cè)皮毛樣品結(jié)果Fig.6 Results of Vipoyion specific kit in detecting fur samples

    3 討論

    在牛、羊等動(dòng)物皮毛攜帶的常見病毒中,BTV、FMDV、GPV和SPPV屬于動(dòng)物高風(fēng)險(xiǎn)疫情疫病病毒,BVDV屬于動(dòng)物中等風(fēng)險(xiǎn)疫情疫病病毒。這幾種病毒通過皮毛及其相關(guān)制品傳播的風(fēng)險(xiǎn)較高,動(dòng)物一旦感染,病死率較高,并且極難消除,一旦形成暴發(fā)和流行趨勢(shì),將對(duì)我國(guó)畜牧業(yè)以及經(jīng)濟(jì)發(fā)展造成重大影響,同時(shí)對(duì)家畜和皮毛相關(guān)從業(yè)人員健康造成重大危害。我國(guó)作為進(jìn)口動(dòng)物皮毛及其制品最多的國(guó)家,這5種病毒一旦傳入我國(guó),將對(duì)我國(guó)對(duì)外貿(mào)易和畜牧業(yè)發(fā)展產(chǎn)生重大打擊,因此需要加強(qiáng)對(duì)進(jìn)口皮毛及其制品攜帶病毒的檢測(cè)。目前,對(duì)皮毛中攜帶病毒檢測(cè)依然使用傳統(tǒng)的技術(shù)方法,主要依靠血清學(xué)方法和PCR技術(shù),這些方法難以實(shí)現(xiàn)對(duì)皮毛樣品的高通量檢測(cè),也不可能對(duì)攜帶的病毒進(jìn)行快速篩選。本研究采用熒光標(biāo)記5種病毒的上游引物,在多重PCR的基礎(chǔ)上建立動(dòng)物皮毛中攜帶5種病毒的基因芯片檢測(cè)技術(shù)。該方法能夠同時(shí)對(duì)5種病毒進(jìn)行檢測(cè),特異性強(qiáng),靈敏度高,可以實(shí)現(xiàn)高通量對(duì)皮毛樣品的快速診斷,適合進(jìn)出境檢驗(yàn)檢疫部門批量樣品檢測(cè)的需求。

    在基因芯片方法建立的過程中,探針的設(shè)計(jì)和選擇至關(guān)重要。使用寡核苷酸片段與標(biāo)記的目的片段雜交是一種常見的芯片檢測(cè)技術(shù)平臺(tái)。寡核苷酸探針在病毒核酸序列中的位置,探針的長(zhǎng)度以及Tm值都會(huì)影響芯片檢測(cè)的特異性、敏感性和雜交信號(hào)的強(qiáng)度[5-7]。相關(guān)的報(bào)道表明15bp~18bp短核苷酸探針可以區(qū)分親緣關(guān)系較近的病毒。本研究考慮到探針在玻璃基片上的空間位租效應(yīng),將堿基長(zhǎng)度不到35bp的探針在其5′端增加T堿基至35 bp。試驗(yàn)的結(jié)果也證實(shí),該方法設(shè)計(jì)的寡核苷酸探針特異性好,熒光信號(hào)強(qiáng)于未加T堿基的其他探針。在基因芯片雜交過程中,雜交液中甲酰胺濃度、雜交溫度以及雜交時(shí)間三者緊密結(jié)合,共同影響著基因芯片雜交的特異性和敏感性。不適當(dāng)?shù)碾s交條件影響芯片雜交信號(hào)的強(qiáng)度,甚至出現(xiàn)假陽性雜交信號(hào)[8-9]。一般首先選擇當(dāng)雜交液中含500mL/L甲酰胺時(shí),在42℃條件下進(jìn)行雜交反應(yīng)。本研究選擇4種不同濃度甲酰胺雜交液進(jìn)行優(yōu)化,同時(shí)對(duì)雜交溫度以及雜交時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化,最終確定基因芯片的最佳雜交條件,檢測(cè)最高靈敏度達(dá)到約20個(gè)拷貝數(shù)。

    盡管基因芯片技術(shù)因其高通量、微型化以及自動(dòng)化等方面的優(yōu)越性而受到廣泛的關(guān)注[10-12],但是作為一種新興技術(shù)還存在著許多亟待解決的問題,如由于該技術(shù)具有很高的敏感性,對(duì)雜交環(huán)境(雜交條件以及實(shí)驗(yàn)環(huán)境)有很高的要求,同一種基因芯片類型,在不同的試驗(yàn)環(huán)境中其特異性和敏感性不同,在本實(shí)驗(yàn)室條件下,前期的雜交試驗(yàn)當(dāng)中遇到過類似的問題??傊?,本試驗(yàn)建立的基因芯片檢測(cè)方法能夠有效的檢測(cè)動(dòng)物皮毛中攜帶的5種病毒,同時(shí)該技術(shù)對(duì)于環(huán)境以及其他臨床樣品中病毒的污染和傳播檢測(cè)提供了一個(gè)技術(shù)平臺(tái)。

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    透射電子顯微鏡中的掃描探針裝置
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    掃描近場(chǎng)光電多功能探針系統(tǒng)
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