藏系綿羊源沙門菌和產(chǎn)志賀毒素大腸埃希菌的分離與PCR鑒定

張 冰，張煥容，2＊，湯 承，2，王 永

（1.西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，四川成都610041；2.動(dòng)物醫(yī)學(xué)四川省高等學(xué)校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川成都610041）

藏系綿羊（Tibetan sheep）是我國三大原始綿羊品種之一，是高原地區(qū)分布最廣、數(shù)量最多的畜種之一，長期繁衍生息在青藏高原及其毗鄰的四川、云南、甘肅的高寒牧區(qū)，一般生活在海拔3 000m以上，是長期自然和人工培育選擇下形成的一個(gè)地方品種［1］。也是藏民族主要的生產(chǎn)資料和生活來源之一。

綿羊的沙門菌?。⊿almonellosis）主要由鼠傷寒沙門菌（Salmonella typhimurium）、羊流產(chǎn)沙門菌（Salmonella abortusovis）和都柏林沙門菌（Salmonella dublin）等引起的，并且沙門菌的許多血清型可使人感染，發(fā)生食物中毒和敗血癥等，是重要的人畜共患?。?］。綿羊的沙門菌感染，不分年齡、性別和品種。以斷奶或斷奶不久的羊較新生羔羊更易感。成年羊中，年輕羊比老齡羊更容易感染，臨床上以血性下痢和懷孕母羊流產(chǎn)為特征。羊群暴發(fā)一次，一般持續(xù)時(shí)間為10d～15d，流產(chǎn)率和病死率可達(dá)60%［3］。另外，隨著分子生物學(xué)研究的深入，人們對(duì)細(xì)菌的毒素、侵襲素與毒力島等毒力因子的認(rèn)識(shí)也在不斷的深入，沙門菌的侵襲蛋白（invasion protein，inv）是由invA、invB、invC、invD和invE等一組基因編碼，其中invA為沙門菌的主要毒力因子，高度保守，幾乎存在于所有血清型沙門菌中，其編碼吸附和侵襲上皮細(xì)胞表面蛋白，決定沙門菌對(duì)腸黏膜細(xì)胞的侵襲力，與其致病性密切相關(guān)［4］。

普通的大腸埃希菌并不導(dǎo)致動(dòng)物患病，但有些大腸埃希菌在漫長的進(jìn)化過程中由于某種原因獲得了毒力基因，因此具備了致病能力。致病性大腸埃希菌引起的大腸桿菌病是一類多種動(dòng)物共患的傳染病，尤其是幼齡動(dòng)物多發(fā)。因致病性大腸埃希菌的血清型不同，表現(xiàn)的病理過程和臨床癥狀也不一致。一般以腸炎多見，有時(shí)還可引起敗血癥和毒血癥，引起動(dòng)物死亡，或者嚴(yán)重影響幼畜生長發(fā)育，并且大腸桿菌病多與其他疾病并發(fā)，給畜牧業(yè)發(fā)展造成重大損失［5］。產(chǎn)志賀毒素大腸埃希菌（Shiga toxin-producing Escherichia coli，STEC）就是其中一種能引起人畜共患病的細(xì)菌，可以引起一系列的人類疾病，包括水樣腹瀉（watery diarrhea）、出血性腸炎（hemorrhagic colitis，HC）、血小板減少性紫癜（thrombotic thrombocytopenic purpura，TTP）、溶血性尿毒綜合征（hemolytic uremic syndrome，HUS）。由STEC引起的消化道疾病在世界各地都有暴發(fā)，這一類病原菌已成為威脅人類健康的重要致病菌［6-9］。STEC能夠產(chǎn)生類志賀毒素（Shiga-like toxins，Stx），包括Stx1和Stx2兩種類型，Stx1的基因序列相對(duì)保守，目前已報(bào)道的有Stx1c（Slt1ox3／Stx1ox3）、Stx1d、Stx1v51／Stx1v52 等［10］。Stx2 基因具有多種亞型包括Stx2c（Stx2vha，Stx2vhb，Stx2vhd）、Stx2d（Stx2d-ount，Stx2d-ox3a，Stx2do111）、Stx2e、Stx2f至少10余種，因Stx基因具有不同的亞型，它們能夠結(jié)合的受體也不同，因此它們感染的對(duì)象和致病特征也各不相同［11-12］。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品 采自四川省紅原縣外觀健康的藏系綿羊肛門拭子19份，低溫運(yùn)送至實(shí)驗(yàn)室。

1.1.2 主要試劑 緩沖蛋白胨水（BPW）、TTB增菌液、SS瓊脂培養(yǎng)基、伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基、麥康凱培養(yǎng)基和XLD培養(yǎng)基，購自杭州微生物試劑有限公司；DNA Marker DL 2 000購自Tiangen公司；EX-TaqDNA聚合酶、dNTP、pMD19-T vector試劑盒購自寶生物工程（大連）有限公司；AXY prepTM DNA膠回收試劑盒購自Axygen公司，其他試劑為國產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.1.3 陽性菌株 產(chǎn)志賀毒素大腸埃希菌陽性菌株O157和沙門菌陽性菌株由西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院動(dòng)物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 沙門菌的分離鑒定

1.2.1 預(yù)增菌 低溫保存運(yùn)送至實(shí)驗(yàn)室的19份藏系綿羊肛門拭子分別置于10mL BPW增菌液中于36℃±1℃培養(yǎng)8h～18h。

1.2.2 增菌 取1mL預(yù)增菌液轉(zhuǎn)接于10mL TTB增菌液內(nèi)，于42℃±1℃培養(yǎng)18h～24h。

1.2.3 分離培養(yǎng) 用接種環(huán)取增菌液，分別劃線接種于SS瓊脂平板和XLD平板，于36℃±1℃培養(yǎng)18h～24h，觀察各平板上生長的菌落，挑取SS平板上灰白色、半透明、圓珠狀、邊緣整齊、光滑濕潤、中心黑色，中等大小的菌落3個(gè)～5個(gè)或透明，針尖大小的菌落和XLD平板上呈粉紅色，帶或不帶黑色中心的菌落3個(gè)～5個(gè)，革蘭染色，鏡檢。然后將典型菌落分別劃線接種于麥康凱平板于36℃±1℃培養(yǎng)18h～24h，觀察平板上生長的菌落，挑取3個(gè)～5個(gè)細(xì)小無色典型菌落，劃線接種于SS瓊脂平板36℃±1℃培養(yǎng)24h進(jìn)一步純化。

1.2.4 大腸埃希菌的分離鑒定 在上述1.2.3的SS瓊脂平板上釣取紅色菌落和XLD平板上釣取黃色菌落各3個(gè)～5個(gè)，經(jīng)革蘭染色，鏡檢。然后將典型菌落分別劃線接種于麥康凱平板于36℃±1℃培養(yǎng)18h～24h，觀察平板上生長的菌落，挑取麥康凱平板上紅色典型菌落接種到伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基上于36℃±1℃培養(yǎng)18h～24h，觀察平板上生長的菌落，培養(yǎng)后取紫黑色并帶金屬光澤的典型菌落劃線接種于麥康凱瓊脂平板上，36℃±1℃培養(yǎng)24h進(jìn)一步純化。

1.2.5 沙門菌和產(chǎn)志賀毒素大腸埃希菌的PCR鑒定

1.2.5.1 沙門菌的PCR鑒定 根據(jù)GenBank中已發(fā)表的沙門菌invA基因的保守基因序列和國內(nèi)外參照文獻(xiàn)［13］合成引物如下：invA-1：5′-GTGAAATTATCGCCACGTTCGGGCAA-3′，invA-2：5′-TCATCGCACCGTCAAAGGAACC-3′，預(yù)期擴(kuò)增片段長度為284bp，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。挑取純化好的單個(gè)沙門菌菌落接種到LB液體培養(yǎng)基中37℃ 過夜培養(yǎng)后作為模板。反應(yīng)體系為10×PCR buffer 2.0μL，10 mmol／L dNTPs 2.5μL，Taq酶0.5μL，模板量為1μL，上游引物1μL，下游引物1μL，滅菌ddH2O 17μL，總體積25μL，然后進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR循環(huán)參數(shù)為：94℃預(yù)變性5min；94℃45s；60℃45s；72℃1min，依次進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；72℃10min。用20 g／L瓊脂糖凝膠電泳分析，膠回收PCR產(chǎn)物、克隆并測(cè)序。

1.2.5.2 產(chǎn)志賀毒素大腸埃希菌雙重PCR鑒定根據(jù)國內(nèi)外參考文獻(xiàn)合成產(chǎn)志賀毒素大腸埃希菌Stx1和Stx2的引物（表1），引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

表1 產(chǎn)志賀毒素大腸埃希菌的引物信息Table 1 Primer information of Shiga toxin-producing Escherichia coli

純化好的產(chǎn)志賀毒素大腸埃希菌經(jīng)LB液體培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)后作為模板。25μL雙重PCR反應(yīng)體系為：TaqDNA聚合酶（5U／μL）0.15μL，MgCl22.5μL（250mmol／L），10×PCR buffer 2.5μL，dNTP 2.5μL （2.5mmol／L），STX1上、下游引物（10μmol／L）各 0.6μL，STX2 上、下游引物 （10 μmol／L）各0.7μL、菌液模板2μL，ddH2O補(bǔ)足25 μL。PCR循環(huán)參數(shù)：94℃ 預(yù)變性5min；94℃30 s；58℃40s；72℃1min，依次進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；72℃10min。用20g／L瓊脂糖凝膠電泳分析，膠回收PCR產(chǎn)物、克隆并測(cè)序。

1.2.6 基因序列同源性分析 由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限責(zé)任公司測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果進(jìn)行同源性分析并運(yùn)用MEGA5.05生物軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

2 結(jié)果

2.1 沙門菌的分離與PCR鑒定結(jié)果

從19份藏系綿羊糞便拭子中分離出沙門菌1株，革蘭染色符合相應(yīng)菌屬的特征。PCR擴(kuò)增出約300bp的特異性條帶（圖1）。

2.2 大腸埃希菌的分離與PCR鑒定結(jié)果

共分離出13株大腸埃希菌，經(jīng)產(chǎn)志賀毒素大腸埃希菌PCR鑒定，其中有4株能擴(kuò)增出目的條帶，這4株中3株只檢測(cè)出了Stx1基因片段，1株只檢測(cè)出了Stx2基因片段（圖2）。

圖1 沙門菌分離株的PCR檢測(cè)結(jié)果Fig.1 PCR amplification of invA gene of isolated Salmonella

圖2 產(chǎn)志賀毒素大腸埃希菌的PCR檢測(cè)結(jié)果Fig.2 PCR amplification of stx1and stx2genes from isolated Escherichia coli strains

2.3 基因同源性分析結(jié)果

應(yīng)用NCBI上的BLAST和DNAMAN軟件分析沙門菌分離株invA基因片段與GenBank上登錄的沙門菌的invA基因同源性高達(dá)99.8%，4株產(chǎn)志賀毒素大腸埃希菌分離株與GenBank上登錄的產(chǎn)志賀毒素大腸埃希菌的stx1和stx2基因同源性都大于95%。

由圖3可知，沙門菌分離株S19invA基因片段與豪頓沙門菌（S.entericasubsp.houtenae）、薩拉姆沙門菌（S.entericasubsp.salamae）、甲型副傷寒沙門菌（S.paratyphi）、雞白痢沙門菌（S.pul-lorum）、雞沙門菌（S.gallinarum）和森夫頓堡沙門菌（S.senftenberg）所含有的invA基因片段在進(jìn)化樹同一枝上，表明S19是沙門菌，但其血清型有待進(jìn)一步鑒定，同時(shí)也說明了invA基因具有較高的保守性，可以作為多種血清型沙門菌檢測(cè)的首選基因。

由圖4進(jìn)化樹可以看出，產(chǎn)志賀毒素大腸埃希菌分離株（S6、S8、S11）具有相同的產(chǎn)志賀毒素基因stx1A和stx1B，S3株只含有stx2A和Sstx2B基因，與其他3株（S6、S8、S11）分離株產(chǎn)志賀毒素基因stx1同源性較低。

圖3 沙門菌分離株S19與NCBI上登錄的主要沙門菌菌株invA基因核苷酸序列進(jìn)化樹Fig.3 Phylogenetic tree of Salmonella S19isolates based on partical invA gene sequences in NCBI database

圖4 產(chǎn)志賀毒素大腸埃希菌分離株與NCBI上登錄的主要產(chǎn)志賀毒素大腸埃希菌菌株stx1和stx2基因核苷酸序列進(jìn)化樹Fig.4 Phylogenetic tree of Shiga toxin-producing Escherichia coli isolatas based on partical stx1and stx2gene sequences in NCBI database