腸出血性大腸桿菌O157∶H7的快速可視化檢測(cè)

呂 恒，張錦海，顧海濤，王 平，王長(zhǎng)軍，王玉邦

(本文編輯:張仲書; 英文編輯:王建東)

腸出血性大腸桿菌(enterohaemorrhagic Escherichia coli，EHEC)主要包括 O157∶H7、O26∶H11、O111和O104等幾種血清型，其中O157∶H7是典型菌株［1］。該病原菌可引起人腹瀉、出血性腸炎、血栓性血小板減少性紫癜和溶血性尿毒癥。EHEC O157∶H7的感染具有暴發(fā)流行、強(qiáng)致病性、高致死率以及抗生素治療可能加劇病情等特點(diǎn)［2］。因此快速、特異的檢測(cè)對(duì)于該病的早期診斷及疫情的有效控制至關(guān)重要。目前我國EHEC的檢測(cè)方法有顯性培養(yǎng)基分離法、免疫磁珠富集、血清凝集等方法。但這些方法存在費(fèi)時(shí)費(fèi)力、檢測(cè)時(shí)限長(zhǎng)等弊端［3］。

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)技術(shù)是 Notomi等［4］建立的一種核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，能在等溫條件下高效、快速、靈敏、特異地?cái)U(kuò)增靶基因。該方法具有靈敏度高、特異性好、反應(yīng)時(shí)間短、判定結(jié)果方便、不需要昂貴儀器等優(yōu)勢(shì)，可廣泛用于病毒病、細(xì)菌病、寄生蟲病的診斷［5-7］。本研究以 EHEC O157∶H7的編碼脂多糖rfbE基因?yàn)榘行蛄性O(shè)計(jì)引物，建立了優(yōu)化的LAMP檢測(cè)技術(shù)，并在此基礎(chǔ)上應(yīng)用金屬離子指示劑羥基萘酚藍(lán)(hydroxy naphthol blue，HNB)判定反應(yīng)結(jié)果，使LAMP的結(jié)果判斷更簡(jiǎn)單直觀，可為基層醫(yī)療機(jī)構(gòu)、疫情現(xiàn)場(chǎng)調(diào)查提供快速可視化的檢測(cè)方法。

1 材料與方法

1.1 主要儀器和試劑 Loopamp DNA擴(kuò)增試劑盒、Loopamp LA-320C實(shí)時(shí)濁度儀(北京藍(lán)譜公司)，羥基萘酚藍(lán)(HNB)(Sigma公司)，細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒、質(zhì)粒抽提試劑盒、DNA 250bp marker等(大連寶生物公司)，Eppendorf 5415R離心機(jī)(德國Eppendorf公司)，BIO-RAD電泳儀(美國Bio-Rod公司)，紫外分光光度計(jì)(美國 Thermo Fisher公司)。

1.2 菌株 EHEC O157∶H7，腸產(chǎn)毒性大腸桿菌(ETEC)、腸致病性大腸桿菌(EPEC)、腸侵襲性大腸桿菌(EIEC)、腸聚集性大腸桿菌(EAEC)、宋內(nèi)志賀菌菌株均由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院饋贈(zèng)；福氏志賀菌由解放軍86醫(yī)院饋贈(zèng)。

1.3 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)GenBank公布的EHEC O157∶H7的 rfbE基因序列(GenBank：S83460)的保守區(qū)，采用引物設(shè)計(jì)軟件Primer Explorer 4.0設(shè)計(jì)LAMP引物及兩條環(huán)引物L(fēng)F、LB，由南京金斯瑞公司合成。引物序列見表1。

表1 LAMP引物序列

1.4 DNA模板的制備 按照試劑盒說明書，使用TaKaRa通用基因組DNA提取試劑盒分別提取EHEC O157∶H7、ETEC、EPEC、EIEC、EAEC、宋內(nèi)志賀菌、福氏志賀菌的基因組DNA。

1.5 LAMP反應(yīng)體系優(yōu)化

1.5.1 HNB指示劑濃度的優(yōu)化 將HNB加入LAMP反應(yīng)體系中，HNB在反應(yīng)前顯紫羅蘭色，發(fā)生LAMP反應(yīng)即變?yōu)樘焖{(lán)色。根據(jù)現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道的HNB 用量有 120 μmol/L［8］、150 μmol/L［9］，本研究選擇了120、150和 200 μmol/L 3個(gè)濃度進(jìn)行HNB顯色對(duì)比。

1.5.2 配制LAMP反應(yīng)體系與溫度優(yōu)化 LAMP反應(yīng)體系總計(jì) 25μl，包括：2 × 反應(yīng)緩沖液 12.5μl，引物混合液 2.5μl(FIP、BIP 各 40 pmol/L，LF、LB各20 pmol/L，F(xiàn)3、B3 各5 pmol/L)，Bst DNA 聚合酶1.0μl，DNA 模板 2μl，HNB 1.0μl(反應(yīng)濃度 150 μmol/L)，ddH2O 6μl。配制同樣的 6 個(gè)反應(yīng)體系，利用LAMP濁度儀分別于61～65℃溫育60 min，最后80℃滅活2 min。以最早出現(xiàn)波峰，擴(kuò)增效率最高為標(biāo)準(zhǔn)選擇最佳反應(yīng)溫度。觀看顏色反應(yīng)與LAMP濁度儀判讀結(jié)果是否一致，產(chǎn)物于25 g/L瓊脂糖凝膠電泳分析驗(yàn)證。

1.6 LAMP快速法與LAMP標(biāo)準(zhǔn)法比較 通過三組試驗(yàn)，觀察LAMP濁度儀實(shí)時(shí)擴(kuò)增曲線、比較體系內(nèi)加環(huán)引物(快速法)與不加環(huán)引物(標(biāo)準(zhǔn)法)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。

1.7 LAMP方法特異性檢測(cè) 將提取的EHEC O157∶H7、ETEC、EPEC、EIEC、EAEC、宋內(nèi)志賀菌、福氏志賀菌基因組DNA作為模板，進(jìn)行LAMP擴(kuò)增，檢驗(yàn)LAMP方法的特異性。反應(yīng)結(jié)束后肉眼觀察反應(yīng)管內(nèi)顏色變化，并與LAMP濁度儀結(jié)果及凝膠電泳結(jié)果對(duì)比驗(yàn)證。

1.8 LAMP方法靈敏度檢測(cè) 將針對(duì)EHEC O157∶H7的rfbE基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物(1094 bp)連接至PMD-18載體上(2692 bp)，連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，篩選并提取重組質(zhì)粒，送金斯瑞公司測(cè)序。用紫外分光光度計(jì)測(cè)定其濃度和純度，計(jì)算質(zhì)?？截悢?shù)。計(jì)算公式：拷貝數(shù)=質(zhì)粒濃度(g/μl)×加樣體積×阿氏常數(shù)/(質(zhì)?？傞L(zhǎng)度×1個(gè)bp的平均分子量)，根據(jù)拷貝數(shù)將質(zhì)粒稀釋成5×106拷貝/μL，然后進(jìn)行10倍梯度稀釋，檢測(cè)107至100拷貝/反應(yīng)管8個(gè)濃度梯度。

2 結(jié)果

2.1 HNB指示劑不同濃度顯色對(duì)比 120、150和200 μmol/L 3個(gè)HNB濃度進(jìn)行顯色對(duì)比，結(jié)果見圖1。多次驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，HNB的濃度為150 μmol/L時(shí)，陰性、陽性顏色對(duì)比差別最明顯，利于可視化判讀。

圖 1 120 μmol/L(左)、150 μmol/L(中)、200 μmol/L(右)的HNB顯色對(duì)比

2.2 LAMP反應(yīng)體系溫度優(yōu)化 對(duì)同一反應(yīng)體系設(shè)置不同溫度進(jìn)行反應(yīng)時(shí)，發(fā)現(xiàn)在63℃時(shí)，LAMP濁度儀最早出現(xiàn)波峰，并且擴(kuò)增效率最高，因此選擇63℃為優(yōu)化溫度進(jìn)行后續(xù)的靈敏度和特異性等實(shí)驗(yàn)。

2.3 LAMP快速法與LAMP標(biāo)準(zhǔn)法比較 通過重復(fù)3次對(duì)比LAMP快速法(加環(huán)引物)與LAMP標(biāo)準(zhǔn)法發(fā)現(xiàn)，LAMP快速法實(shí)時(shí)濁度儀顯示在15 min開始有擴(kuò)增產(chǎn)物的出現(xiàn)，在40 min時(shí)接近擴(kuò)增產(chǎn)物峰值；而LAMP標(biāo)準(zhǔn)法在30 min的時(shí)候出現(xiàn)擴(kuò)增產(chǎn)物，在60 min時(shí)接近產(chǎn)物峰值(圖2)。因此在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，全部加環(huán)引物。

2.4 特異性檢測(cè) 僅EHEC O157∶H7反應(yīng)管HNB顏色由紫羅蘭色變成天藍(lán)色，LAMP濁度儀檢測(cè)到陽性擴(kuò)增結(jié)果，而 ETEC、EPEC、EIEC、EAEC、宋內(nèi)志賀菌、福氏志賀菌反應(yīng)管均未發(fā)生顏色變化，LAMP濁度儀也未出現(xiàn)擴(kuò)增曲線，均為陰性。通過凝膠電泳驗(yàn)證，僅EHEC O157∶H7出現(xiàn)LAMP特有的梯狀條帶，ETEC、EPEC、EIEC、EAEC、宋內(nèi)志賀菌、福氏志賀菌均未出現(xiàn)。結(jié)果與HNB，LAMP濁度儀判讀結(jié)果一致。見圖3、4、5。

圖3 LAMP濁度儀特異性檢測(cè)結(jié)果

圖 3、4、5 中，1 為 EHEC O157∶H7；2 為 ETEC；3 為EPEC；4為ETEC；5為EAEC；6為宋內(nèi)志賀菌；7為福氏志賀菌；8為陰性對(duì)照。圖5中M為250 bp DNA marker。紅色：陽性；綠色：陰性；藍(lán)色：累計(jì)濁度

圖4 HNB特異性檢測(cè)結(jié)果

圖5 凝膠電泳特異性檢測(cè)驗(yàn)證結(jié)果

2.5 靈敏度檢測(cè) 測(cè)序證實(shí)rfbE基因成功克隆到PMD-18載體上。經(jīng)紫外分光光度計(jì)測(cè)定顯示質(zhì)粒濃度為21.52 ng/μl。檢測(cè)結(jié)果顯示從107～102拷貝/反應(yīng)管出現(xiàn)陽性擴(kuò)增，10個(gè)拷貝/反應(yīng)管以下為陰性。HNB、LAMP濁度儀及凝膠電泳結(jié)果一致，見圖 6、7、8。

圖6 LAMP濁度儀靈敏度檢測(cè)結(jié)果

圖6、7、8中，1～8分別為 O157∶H7 質(zhì)粒模板 107～100拷貝/反應(yīng)管，圖8中M為250 bp DNA marker。本方法的檢測(cè)靈敏度是100拷貝/反應(yīng)管。紅色：陽性；綠色：陰性；藍(lán)色：累計(jì)濁度

圖7 HNB指示劑靈敏度檢測(cè)結(jié)果

圖8 凝膠電泳靈敏度檢測(cè)結(jié)果

3 討論

傳統(tǒng)的EHEC O157∶H7的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法耗時(shí)久，檢出率低，在食品衛(wèi)生檢測(cè)與疫情現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)領(lǐng)域缺少快速簡(jiǎn)易的檢測(cè)方法。核酸檢測(cè)具有高靈敏度與特異性。LAMP技術(shù)原理與普通PCR技術(shù)不同，具有諸多優(yōu)點(diǎn)：一是同時(shí)針對(duì)目的片段8個(gè)不同區(qū)域，設(shè)計(jì)6條LAMP引物及2條環(huán)引物，因而具有特異性高的特點(diǎn)。二是由于其反應(yīng)是等溫條件，不需要像普通PCR循環(huán)升溫降溫，因而對(duì)設(shè)備要求低，普通的恒溫水浴鍋即可。三是其反應(yīng)形成啞鈴狀結(jié)構(gòu)，核酸復(fù)制延伸的同時(shí)發(fā)生鏈置換反應(yīng)，剝離先前合成的DNA鏈，產(chǎn)物是不同長(zhǎng)度目的片段的重復(fù)序列，擴(kuò)增效率高，1 h內(nèi)可將少量目的片段擴(kuò)增至109［10］。四是在添加環(huán)引物情況下，增加了反應(yīng)的起始點(diǎn)位，提高了反應(yīng)的速率，在更短的時(shí)間內(nèi)就能出結(jié)果。五是其觀察結(jié)果方式多。

如果通過開蓋去檢測(cè)LAMP反應(yīng)結(jié)果，容易造成氣溶膠污染，影響后續(xù)檢測(cè)。在不開蓋的前提下，其結(jié)果判定方式主要有目視檢查渾濁、目視檢查染料顏色變化和利用濁度儀對(duì)LAMP反應(yīng)進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)控這三種方法［11］。目視檢查渾濁法主要依據(jù)LAMP反應(yīng)產(chǎn)生了大量的副產(chǎn)物焦磷酸鎂白色沉淀，但當(dāng)產(chǎn)物較少時(shí)，肉眼很難察覺。實(shí)時(shí)濁度儀能夠更加直觀、精確地判定結(jié)果，但需要使用特定的儀器設(shè)備LAMP濁度儀，其價(jià)格昂貴，適合摸索反應(yīng)條件、科學(xué)研究用，并不適合現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。染料比色分析便捷、直觀，是最為簡(jiǎn)單方便的LAMP結(jié)果判定方式，而使用HNB染料指示劑既不開蓋靈敏度又高。

本研究采用通過LAMP濁度儀優(yōu)化檢測(cè)條件，在反應(yīng)前加入HNB染料通過顏色變化判斷結(jié)果，通過凝膠電泳驗(yàn)證HNB顏色變化判讀結(jié)果的準(zhǔn)確性。結(jié)果顯示，HNB指示劑陰、陽性結(jié)果顏色差別明顯，易于判斷，并且與LAMP濁度儀及凝膠電泳結(jié)果判讀一致，說明基于HNB染料的LAMP方法結(jié)果可信。在加了環(huán)引物L(fēng)F、LB后，增加了DNA擴(kuò)增的起點(diǎn)，擴(kuò)增結(jié)果較不加環(huán)引物提前了20 min，在40 min內(nèi)即可出結(jié)果。本方法檢測(cè)的靈敏度達(dá)到100拷貝/反應(yīng)管，靈敏度和實(shí)時(shí)熒光定量PCR相近，比普通PCR高100倍［12-13］。本法特異性強(qiáng)，僅EHEC O157∶H7 陽性，ETEC、EPEC、EIEC、EAEC、宋內(nèi)志賀菌、福氏志賀菌均為陰性。本研究建立了EHEC O157∶H7環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增可視化檢測(cè)方法，整個(gè)反應(yīng)在63℃恒溫條件下進(jìn)行40 min便能直接判定結(jié)果，無需特殊儀器設(shè)備，簡(jiǎn)便易行，可用于食品衛(wèi)生安全抽檢及疫情現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。

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