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      耐異煙肼和鏈霉素的結核分枝桿菌臨床分離株與敏感株差異蛋白表達研究

      2013-08-14 04:08:54何秀云朱傳智逄宇黃香玉蔣麗氣趙雁林莊玉輝
      中國防癆雜志 2013年3期
      關鍵詞:核糖體菌體定量

      何秀云 朱傳智 逄宇 黃香玉 蔣麗氣 趙雁林 莊玉輝

      目前,結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis Mtb)H37Rv全基因組序列已知,但許多蛋白質功能仍不清楚。Mtb耐藥機制、致病機制研究還有待于揭示更多Mtb蛋白功能。雖然,目前治療結核病依然采用利福平(RFP)、異煙肼(INH)、鏈霉素(S)和吡嗪酰胺(PZA)的聯(lián)合化療,但RFP、INH和S耐藥現(xiàn)象嚴重。研究發(fā)現(xiàn)INH耐藥的分子診斷標識有katG,inhA,kasA,oxyR-ahpC 間隔區(qū)突變,但仍有高達40%的耐INH菌株不能檢測到上述基因突變[1]。編碼核糖體S12蛋白的rpsL 基因突變(K43R,K88Q)是S耐藥的主要分子標識,其次是編碼16SrRNA的rrs基因突變(530莖環(huán)和915位核苷酸)[2]。但仍有約30%S耐藥結核分枝桿菌未檢測到rpsL或rrs基因突變,推測結核分枝桿菌S耐藥還存在其他機制[3]。

      宿主免疫功能和感染的Mtb毒力強弱決定了機體感染Mtb的結果。不同Mtb臨床分離株和不同分枝桿菌的差異可從基因水平進行解釋,已發(fā)現(xiàn)增強胞內(nèi)生長基因(enhanced intracellular survival,eis)、增強胞內(nèi)生長速率的基因(in vivo growth,ivg),增強侵入位點(mycobacterial enhanced entry locus,mel2)與 Mtb毒力有關[4-5]。但基因表達與否與所處的環(huán)境有關,單從基因水平無法解釋菌株在不同培養(yǎng)條件下差異表達蛋白[6]。

      尋找與結核分枝桿菌INH和S耐藥相關的新蛋白,以進一步解析結核分枝桿菌INH和S耐藥機制是以后研究工作的重點內(nèi)容之一。蛋白質組學可全面了解某組織、細胞器、甚至某生物的整體蛋白,其在疾病診斷標識、疾病機制研究等方面已發(fā)揮重要作用?;诮?jīng)典雙向凝膠電泳的蛋白質組學存在低分辨率和低敏感度,以及無法對不溶性蛋白質、高分子量蛋白質、極酸性蛋白質和極堿性蛋白質進行分析的缺點。而定量蛋白質組學能全面定量分析差異表達蛋白,為大范圍鑒定蛋白及其復合物提供了有效的途徑[7]。核素標記相對和絕對定量(isobaric tags for relative and absolute quantitation,iTRAQ)技術是美國Applied Biosystems公司研發(fā)的一種新的體外多肽標記技術,該技術定量準確性高,聯(lián)用液相色譜分離彌補了凝膠分離在蛋白質疏水性,相對分子質量和等電點方面的限制[10];該技術不僅可以對任何類型的蛋白質進行鑒定,并可同時對8個樣品進行定量,從而縮小了不同樣品不同批次間的試驗誤差,有較好的重復性[8]。本研究采用iTRAQ技術分析耐INH和S的Mtb臨床分離株02166、INH和S敏感株01105和H37Rv的菌體蛋白,通過Mascot搜索及生物信息學對蛋白定量分析,旨在尋找與結核分枝桿菌INH和(或)S耐藥相關的新蛋白。

      材料和方法

      一、菌株

      Mtb臨床分離株02166和01105由國家疾病預防控制中心國家結核病參比實驗室從臨床分離、鑒定(毒力、耐藥性和基因型)和保存。02166菌株和01105菌株均為北京基因型、毒力高于H37Rv。02166菌株對INH和S耐藥、對RFP、EMB、Km、Ofx敏感,01105菌株對上述抗結核藥均敏感。02166菌株、01105菌株及H37Rv抽提菌體蛋白的菌體由國家結核病參比實驗室提供。菌體經(jīng)鈷60照射滅活,保存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

      二、主要試劑和儀器

      iTRAQ-8plex標試劑盒購自ABI公司;胰蛋白酶(trypsin)、三乙基碳酸氫銨(triethylammonium bicarbonate,TEAB)購自Sigma公司;Bradford定量試劑盒購自美國伯樂Bio-Rad公司;三氯乙酸(trichloroacetic acid,TCA)、羥乙基哌嗪乙硫磺酸{2-[4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl]ethanesulfonic acid,HEPES}、3-[3-(膽酰胺丙基)二甲氨基]丙磺酸內(nèi)鹽{3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonium]-1-propanesulfonate,CHAPS}、苯甲基磺酰氟化物(phenylmethyl sulfonylfluoride,PMSF)、二硫蘇糖醇(dithiothreitol,DTT)、十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate,SDS)、乙腈、碘乙酰胺(iodoacetamide,IAM)等試劑均為進口分裝試劑,磷酸二氫鉀(KH2PO4)、氯化鉀(KCl)、丙酮、甲酸等為國產(chǎn)分析純。低溫超高壓連續(xù)細胞破碎機JN3000為廣州聚能生物科技有限公司產(chǎn)品;超聲波細胞粉碎儀JY92-Ⅱ為寧波新芝生物科技股份有限公司產(chǎn)品;半制備型高壓液相色譜 (high pressure liquid chromatography,HPLC)系統(tǒng)為日本島津產(chǎn)品,Luna 5uSCX 100A色譜柱(250×4.60mm,5μm)為美國菲羅門公司(Phenomenex)產(chǎn)品;Nano-LC MicroTOF-QⅡ為美國Bruker公司產(chǎn)品;C18反相色譜柱(100×0.075mm,5μm)為美國 Agilent產(chǎn)品。

      三、菌體蛋白iTRAQ分析

      (一)菌體蛋白提取

      滅活的 Mtb經(jīng)1×PBS(pH 7.4)洗滌30min,4℃、8000×g離心30min,棄上清。30ml裂解液[Tris-Cl 20mmol/L,pH 8.5;1mmol/L乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid,EDTA),1mmol/L PMSF充分懸浮沉淀,低溫超高壓連續(xù)細胞破碎機將菌細胞破碎、功率不超過1500W,1次循環(huán)后將菌液再重新進樣,4次循環(huán)破菌,溶液總體積不超過50ml。4℃、20000×g離心30min,取20ml上清加入5ml 50%TCA/丙酮(100ml丙酮溶解50g TCA),冰水浴2h,4℃、20000×g離心30min。-20℃預冷丙酮洗滌沉淀3次,每次洗滌均4℃、20000×g離心30min;沉淀自然晾干,即為制備好的Mtb全菌體蛋白樣品,凍存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

      (二)菌體蛋白復溶及定量

      取部分制備好的Mtb全菌體蛋白樣品沉淀于1.5ml離心管,加入復溶緩沖液(8mol/L尿素,4%CHAPS,30mmol/L HEPES,pH 調(diào)至8.0~8.3),加入PMSF至終濃度1mmol/L、EDTA至終濃度2mmol/L,混勻并冰上放置5min。加入DTT至終濃度10mmol/L,超聲(超聲波發(fā)射2s、間歇3s、功率240W)5min助溶,15℃、20000×g離心25min。取上清,加入DTT至終濃度10mmol/L,56℃恒溫水浴1h,迅速加入IAM至終濃度55~100mmol/L,暗室室溫靜置1h。加入4倍于樣品溶液體積的預冷丙酮,-20℃沉淀至少3h。4℃、20000×g離心20min,棄上清。300μl 50%TEAB、0.1%SDS溶液復溶沉淀,超聲(超聲波發(fā)射2s、間歇3s、功率240W)3min助溶。Bradford試劑盒測定蛋白質含量。

      (三)蛋白質酶解

      每個樣品取100μg蛋白,含0.1%SDS的50%TEAB補齊體積至3個樣品為相同體積。每100μg蛋白質樣品加入3.3μg胰蛋白酶,37℃水浴24h;補加1μg胰蛋白酶,37℃水浴12h。酶解樣品真空冷凍干燥,30μl含0.1%SDS的50%TEAB復溶肽段。取1μl復溶肽段經(jīng)ZipTip?Pipette Tips脫鹽,1μl基質洗脫的蛋白樣品直接上樣基質輔助激光解析電離飛行時間質譜儀(matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry,MALDI-TOF-MS)檢測肽質量指紋圖譜以評價胰蛋白酶消化效果。

      (四)標記肽段

      將iTRAQ-8plex標記試劑盒中的標記試劑(113、115和121)平衡至室溫,每管標記試劑中加入70μl異丙醇,顛倒混勻后加入到對應的酶解肽段樣品中,113標記臨床分離株01105、115標記臨床分離株02166、121標記 H37Rv?;靹?、稍離心后,室溫靜置2h。

      (五)半制備型HPLC分離肽段

      A 液(25%乙腈,10mmol/L KH2PO4,磷酸調(diào)pH值至3.0孔徑0.22μm有機膜過濾)平衡系統(tǒng),10~20min;標記的樣品用A液稀釋10倍,全部上樣,流速1ml/min。洗脫梯度:0%~5%B液(25%乙腈,2mol/L KCl,10mmol/L KH2PO4,磷酸調(diào)pH值至3.0,孔徑0.22μm 有機膜過濾),1min;5%~30%B液,20min;30%~50%B液,5min;50%B液,5min;50%~100%B液,5min;分部收集樣品。收集樣品用C18反相色譜柱除鹽,低溫抽干、0.1%甲酸復溶肽段用于Nano LC分離。

      (六)Nano LC分離及質譜鑒定

      HPLC分離并脫鹽的0.1%甲酸復溶肽段上樣。流動相 A 液:H2O,0.1%甲酸;B液:乙腈,0.1%甲酸。洗脫梯度為:0%~5%B液,0~10min;5%~45%B液,10~80min;45%~80%B液,80~85min;80%B液,85~100min;80%~5%B液,100~105min;5%B 液,105~120min。流速0.0003ml/min。Nano LC 分離的樣品直接注入MicroTOF-QⅡ質譜儀,一級質譜(mass spectrometry,MS)掃描質荷比(m/z)范圍為300~2000。每個一級質譜圖自動選擇3個最強母離子進行串級掃描,MS-MS掃描 m/z范圍為200~3000,每組樣品質譜鑒定3次重復。MicroTOF-QⅡ質譜儀檢測參數(shù):離子源(ESI,正離子掃描),掃描范圍(Auto MS2,m/z 50~2000),Set capillary(1400V),干燥熱源 (150 ℃),碰 撞池 (500.0VPP),傳輸時 間(150μs),前脈沖存儲時間(2.0μs),校準方法(自動調(diào)諧優(yōu)化電壓,外標法校準質量數(shù))。

      (七)生物信息學分析

      質譜掃描完畢,得到質譜信號圖。質譜數(shù)據(jù)分析軟件DataAnalysis 4.0(美國Bruker公司)打開質譜信號圖,打開baf數(shù)據(jù),自動分析標峰得到mgf文件。合并mgf文件。將合并后的mgf文件進行Mascot檢索(SwissProt下載的Mtb數(shù)據(jù)庫為搜索數(shù)據(jù)庫進行本地搜索)。Mascot檢索參數(shù):酶(enzyme):胰蛋 白 酶 (trypsin);數(shù) 據(jù) 庫 (database):swissprot-rat;肽段電荷 peptide charge:+,++,+++;儀器(instrument):ESI-QUAD-TOF;固定修飾(fixed modification):脲甲基化carba-midomethyl(C);可變修飾(variable modification):Gln->pyro-Glu(N-term Q),氧化反應 oxidation(M),iTRAQ-8plex(K),iTRAQ-8plex(N-term)和iTRAQ-8plex(Y);肽質量值誤差范圍(peptide tol):0.1u(monoisotopic);MS-MS碎片離子的質量值誤差范圍(MS-MS tol):0.1u;最大錯配(max missed cleavages):1。篩選:P<0.05。差異表達蛋白質定量以Mascot搜庫結果為基礎,以mz 113和mz 121為對照組,依據(jù)Mascot的加權方式,根據(jù)一組肽段核素報告基團的相對含量的比例進行定量,02166菌株分別與01105菌株和H37Rv的直接比值顯示相對定量結果,根據(jù)不同肽段鑒定次數(shù)進行統(tǒng)計學分析,從而判定相對定量結果的統(tǒng)計學意義(P<0.05)[9](DataAnalysis 4.0軟件直接給出統(tǒng)計結果,P<0.05或P>0.05)。若蛋白質標記的報告基團信息丟失,則該蛋白無定量信息。

      結 果

      一、菌體蛋白鑒定及相對定量

      02166菌株與01105菌株比較有153個差異表達蛋白,其中,表達上調(diào)蛋白12個(3個蛋白上調(diào)倍數(shù)>1.2);表達下調(diào)蛋白141個(104個蛋白下調(diào)倍數(shù)<0.8)。02166菌株與 H37Rv菌株比較有129個差異表達蛋白,表達上調(diào)蛋白33個(20個蛋白上調(diào)倍數(shù)>1.2);表達下調(diào)蛋白96個(67個蛋白下調(diào)倍數(shù)<0.8)。

      01105菌株與H37Rv菌株比較差異表達蛋白有130個,表達上調(diào)蛋白113個(74個蛋白上調(diào)倍數(shù)>1.2);下調(diào)表達蛋白27個(11個蛋白下調(diào)倍數(shù)<0.8)。

      02166菌株與01105菌株和H37Rv比較共同差異表達蛋白有86個,共同表達下調(diào)69個(其中Rv3118、Rv2626c和Rv2986c表達下調(diào)倍數(shù)<0.5),共同表達上調(diào)6個(Rv0234c和Rv2466c表達上調(diào)倍數(shù)>1.2),11個蛋白表達下調(diào)或上調(diào)不一致表1 67個蛋白在02166菌株與01105菌株比較中差異表達,卻在02166菌株與H37Rv比較中無差異表達;43個蛋白在02166菌株與H37Rv比較中差異表達,卻在02166菌株與01105菌株比較中無差異表達。

      二、差異表達蛋白相對分子質量和等電點分布

      02166菌株與01105菌株或H37Rv比較無冗余的差異表達蛋白共196個,其理論相對分子質量和等電點分布廣泛,相對分子質量范圍為7.63~326.22;等電點范圍為3.74~12.48。83.4%差異表達蛋白相對分子質量小于60,77.4%差異表達蛋白等電點小于7(圖1A,B)。

      三、差異表達蛋白功能分析

      根據(jù)巴斯德研究所功能分類樹(http://genolist.pasteur.fr/tuberculist)對差異表達蛋白進行功能分類,差異表達蛋白主要參與脂類代謝(1)、中間代謝和呼吸(7)和保守假定蛋白(10);兩組差異表達蛋白均無屬于穩(wěn)定RNAs(4)、插入序列和噬菌體(5)、PE/PPE 家 族 蛋 白 (6)、未 知 功 能 蛋 白 (8)(圖2)。

      四、核糖體蛋白和參與脂類代謝蛋白

      9個核糖體蛋白在02166菌株與01105菌株和H37Rv比較中均下調(diào)表達,其中Rv0056、Rv0651、Rv0652、Rv0701和Rv0719為50S核糖體蛋白,Rv2785c、Rv2909c和Rv3458c為30S核糖體蛋白,Rv1630為可能的核糖體蛋白S1。Rv0641(50S核糖體蛋白)和Rv0707(30S核糖體蛋白)僅在02166菌株與01105菌株比較中下調(diào)表達,Rv2442c和Rv3456c(50S核糖體蛋白)僅在02166菌株與H37Rv比較中分別下調(diào)和上調(diào)表達。

      表1 02166菌株與01105菌株和H37Rv比較表達上調(diào)或下調(diào)不一致的蛋白

      34個脂類代謝(1)蛋白在INH耐藥菌株中差異表達:Rv3804c、Rv3140、Rv2245、Rv0824c、Rv1925、Rv3130c、Rv3801c、Rv1094、Rv2941和 Rv3800c在02166菌株與01105菌株和H37Rv比較中均下調(diào)表達;Rv0154c、Rv0222、Rv0242c、Rv0503c、Rv1070c、Rv1492、Rv2187、Rv2247、Rv2831 和 Rv3274c在02166菌株與01105菌株比較中下調(diào)表達,Rv0873和Rv1181在02166菌株與01105菌株比較中上調(diào)表達;Rv0231、Rv1074c、Rv1483、Rv2244、Rv2246、Rv2524c、Rv2940c、Rv3720和 Rv3774在02166菌株與H37Rv比較中下調(diào)表達,而Rv1543、Rv1544和Rv3061c在02166菌株與H37Rv比較中上調(diào)表達。

      討 論

      研究表明iTRAQ技術可用于鑒定大分子、極酸、極堿蛋白,不僅可以彌補雙向電泳不足,而且iTRAQ定量鑒定的蛋白數(shù)量多于經(jīng)典雙向凝膠電泳[10]。本研究采用iTRAQ技術有效地定量鑒定了耐INH和S Mtb臨床分離株02166、藥物敏感臨床分離株01105和標準株H37Rv之間的差異蛋白,02166菌株菌體蛋白與01105菌株和H37Rv比較共同差異表達蛋白有86個,且差異表達蛋白的相對分子質量和等電點分布范圍廣泛。

      katG (Rv1908c)、aphC (Rv2428)、kasA(Rv2245)和inhA(Rv1484)基因突變與部分耐INH的 Mtb臨床分離株相關[11-12]。Rv2245和 Rv1484參與脂肪酸合成,Rv1908c和Rv2428參與解毒作用。本研究發(fā)現(xiàn),Rv1908c和Rv2245在02166菌株與01105菌株和H37Rv比較中均下調(diào)表達,Rv2428只在02166菌株與H37Rv比較中下調(diào)表達,Rv1484在02166菌株與01105菌株和H37Rv比較中均未出現(xiàn)差異表達。藥物S主要與細菌核糖體30S亞基單位結合,抑制蛋白合成。研究表明,rpsL和rrs基因突變與S耐藥相關[13],rpsL編碼30S核糖體蛋白S12(Rv0682)。本研究未鑒定到Rv0682,但發(fā)現(xiàn)9個核糖體蛋白在02166菌株與01105菌株和H37Rv比較中均下調(diào)表達,其中Rv0056、Rv0651、Rv0652、Rv0701和Rv0719為50S核糖體蛋白,Rv2785c、Rv2909c和Rv3458c為30S核糖體蛋白,Rv1630為可能的核糖體蛋白S1。生物信息學分析發(fā)現(xiàn) Rv0056、Rv0652、Rv0701、Rv1630和Rv2785c在Mtb中均為藥物/化合物優(yōu)先作用靶點(http://tdrtargets.org/)。但這5個核糖體蛋白在02166菌株中下調(diào)表達與Mtb S耐藥的關系,有待進一步試驗驗證。

      基于雙向電泳的蛋白質組學的研究鑒定到5個蛋白(Rv1446c、Rv3028c、Rv0491、Rv2971和Rv2145c)在INH耐藥Mtb中上調(diào)表達[14]。S耐藥株上調(diào)表達Rv0350、Rv0440、Rv1240、Rv3075c、Rv2971、Rv3028c、Rv2145c、Rv2031c和 Rv0569,進一步采用silico docking分析表明只有Rv0350、Rv0440和Rv2971與S呈現(xiàn)有意義的相互作用[15]。因此,Rv2971、Rv3028c和Rv2145c在S耐藥株和INH耐藥株中均上調(diào)表達。本研究發(fā)現(xiàn)Rv0440、Rv2145c和Rv3028c在02166菌株與01105菌株和H37Rv比較中均下調(diào)表達,Rv0350和Rv2971、Rv1240分別在02166菌株與01105菌株比較中上調(diào)和下調(diào)表達、Rv3075和Rv2031在02166菌株與H37Rv比較中下調(diào)表達,Rv0491、Rv0569和Rv1446c在本研究中未鑒定到。這種不同蛋白質組學方法發(fā)現(xiàn)不同差異表達蛋白的現(xiàn)象較常見[16]。

      綜上所述,定量蛋白質組學能有效鑒定到差異表達蛋白。Rv0234c、Rv2466c、Rv3118、Rv2626c和Rv2986c在02166菌株與01105菌株和H37Rv比較中均差異表達(下調(diào)倍數(shù)<0.5或上調(diào)倍數(shù)>1.2),9個核糖體蛋白在02166菌株與01105菌株和H37Rv比較中均下調(diào)表達。這些蛋白與INH和S耐藥關系還未見報道,因此,值得進一步探討這些蛋白與Mtb INH、S耐藥的關系,為進一步研究結核分枝桿菌INH、S耐藥機制提供新靶點。

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