超聲波提取金針菇根中的蛋白質(zhì)*

張樂，宋洪波，周林燕，李鵬，魏明，彭春紅，李亞茹，曹珍珍，李淑榮

1 (福建農(nóng)林大學食品科學學院，福建 福州，350002)2 (中國農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所/農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品加工綜合性重點實驗室，北京，100193)

金針菇(Flammunlina velutipes)為擔子菌目金錢菌屬，是一種藥食兩用真菌。金針菇含有豐富的多糖、蛋白質(zhì)、多種維生素(VB1、VB2、VC、Vpp)、礦物質(zhì)和18 種氨基酸，其中精氨酸和賴氨酸等人體必需氨基酸的含量高于其他菇類［1-3］。金針菇中的生物活性物質(zhì)多糖、火菇素、倍半萜、免疫調(diào)節(jié)蛋白等具有抗氧化、抗疲勞、提高記憶力、減緩細胞衰老等功效［4-6］。隨著人們對其營養(yǎng)價值的認識，金針菇的消費量越來越大。而金針菇菌柄基部(俗稱金針菇根)因其雜質(zhì)、纖維素等成分較多，口感較差，售前或食用前被切下來直接被當作垃圾扔掉。這些下腳料中仍然含有大量的蛋白質(zhì)、纖維素等營養(yǎng)成分及活性成分，造成極大浪費［7-8］。

為了充分開發(fā)利用金針菇廢棄菌根，有效提高金針菇下腳料的價值，滿足工業(yè)產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的要求，本文以金針菇菌柄基部(菌根)為材料，進行超聲輔助提取菌根蛋白的研究，并利用響應面分析法進行提取工藝優(yōu)化，以獲得最佳工藝參數(shù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

金針菇，購于北京市天秀路菜市場;NaCl、NaOH、鹽酸等，購于國藥化學試劑有限公司，分析純;牛血清蛋白、考馬斯亮藍G-250，購于美國Sigma 公司。

1.2 儀器與設備

DHP-9140A 電熱恒溫鼓風干燥箱，上海一恒科學儀器有限公司;SL-100 型高速多功能粉碎機，浙江省永康市松青五金廠;KQ2200DE 型數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司;pB-10 sartorius 普及型pH 計，美國賽多利斯科學儀器(北京)有限公司;HH-4 數(shù)顯恒溫水浴鍋，江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司;GL-20G-Ⅱ型高速冷凍離心機，上海安亭科學儀器廠;全自動凱氏定氮儀，丹麥FOSS 公司;TU-1901 雙光束紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 金針菇菌根粉末的制備

將金針菇清理去雜后把上部子實體和菌根切分，取菌根放入電熱鼓風干燥箱50℃烘至恒重，萬能粉碎機粉碎，過100 目篩貯于干燥器備用。

1.3.2 金針菇菌根蛋白的提取

稱取已制備好的金針菇菌根粉，按料液比1∶15(g:mL)加入稀鹽提取劑(0.14 mol/L NaCl)搖勻，調(diào)pH10，移入超聲波清洗器，設置不同的提取溫度、時間、超聲功率提取蛋白。將料液轉(zhuǎn)入離心管8 000 r/min 離心20 min，取上清液，考馬斯亮藍法測蛋白含量。

1.3.3 牛血清白蛋白標準曲線的繪制

準確稱取10 mg 牛血清白蛋白，溶于蒸餾水并定容至100 mL，配制成100 μg/mL 的牛血清白蛋白標準溶液，分別取出0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL 于6支具塞試管，分別加水補足到1 mL，然后各加入5 mL考馬斯亮藍G-250 蛋白試劑蓋上塞子，搖勻，室溫靜置2 min 后在595nm 波長下比色測定。以牛血清白蛋白含量(μg)為橫坐標，以吸光度為縱坐標，繪出標準曲線，得回歸方程Y=0.006 4X + 0.005 6，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 1。

1.3.4 蛋白提取率計算

蛋白提取率/% =(上清液中蛋白質(zhì)量/菌根粉中總蛋白質(zhì)量)×100

其中菌根粉總蛋白測定采用凱氏定氮法(GB/T 15673 -2009);提取液蛋白的測定采用考馬斯亮藍G-250 法［9-10］。

1.3.5 單因素試驗

在堿提基礎(chǔ)上以料液比1∶15(g∶mL)、0.14 mol/L NaCl 為提取試劑、提取液pH 10 進行單因素實驗，考察超聲功率、超聲溫度、超聲時間、超聲材料4 個因素對菌根蛋白提取效果的影響。單因素試驗條件見表1。

表1 超聲提取的單因素試驗條件Table 1 Single factor experiment of ultrasonic extraction conditions

1.3.6 響應面試驗設計

在單因素試驗基礎(chǔ)上，以超聲功率、提取溫度、時間為自變量，蛋白提取率為響應(y)，采用Box-Behnken 設計三因素三水平試驗，建立超聲輔助提取金針菇菌根蛋白的二次多項式數(shù)學模型［11］。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Origin 8.0 軟件進行數(shù)據(jù)處理和繪圖;通過Design-Expert.8.05b 軟件進行響應曲面模型建立和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌根蛋白提取率影響因素的研究

2.1.1 超聲功率對蛋白提取率的影響

不同超聲功率對金針菇菌根蛋白提取率的影響試驗結(jié)果見圖1。由圖1 可以看出隨著超聲波功率的增加，蛋白提取率先增大后減小，當超聲波功率為120 W 時，提取率達最大值。分析是因為當功率較小時，超聲波作用力度不夠，造成提取不充分;隨著超聲功率的增加，對細胞破壁作用增強，細胞破裂程度大，胞內(nèi)蛋白釋放出來。但當超聲波功率過大時，空化泡在聲波膨脹相內(nèi)來不及發(fā)生崩潰，太高的聲強產(chǎn)生的大量空泡通過反射聲波而減少了能量的傳遞。另外，當超聲波功率較大時會使其他物質(zhì)溶出，阻礙蛋白質(zhì)溶出［12］。因此超聲波功率繼續(xù)增大時，蛋白質(zhì)提取率反而有所下降。

圖1 超聲功率對蛋白質(zhì)提取率的影響Fig.1 Effect of ultrasonic power on protein extraction rate

2.1.2 超聲溫度對蛋白提取率的影響

不同超聲溫度對金針菇菌根蛋白提取率的影響試驗結(jié)果見圖2。由圖2 可以看出，蛋白提取率隨著超聲溫度的增加而增大，在30℃時達到最大，之后隨溫度上升提取率反而下降。溫度升高、分子之間熱運動加劇，促使提取過程中傳質(zhì)速率上升，提取速率加快。在溫度相對較低的情況下，超聲空化作用能促使金針菇組織中蛋白最大限度溶出。另一方面，提取時蒸汽壓隨溫度的升高而上升，這將導致空化強度或空化效應下降［13］，從而不利于提取過程的強化，故當溫度超過某一限度后，提取率反而下降。

圖2 超聲溫度對蛋白質(zhì)提取率的影響Fig.2 Effect of ultrasonic temperature on protein extraction rate

2.1.3 超聲時間對蛋白提取率的影響

不同超聲時間對金針菇菌根蛋白提取率的影響試驗結(jié)果見圖3。超聲波通過波源的振蕩作用，使提取物的外表收到機械損傷和破碎，使溶脹的時間大大地減少。由圖3 可以看出前20 min 提取率迅速增加，這主要因為超聲空化作用能使蛋白在較短時間內(nèi)最大限度溶出，之后提取率隨時間的延長而降低，可能是因長時間超聲空化作用導致蛋白變性［14］，使提取率呈下降趨勢。從經(jīng)濟實用的角度考慮，選取20 min 作為后續(xù)的提取時間。

圖3 超聲時間對蛋白質(zhì)提取率的影響Fig.3 Effect of ultrasonic time on protein extraction rate

2.1.4 超聲材料對蛋白提取率的影響

不同質(zhì)地的材料對金針菇蛋白的超聲波提取也有著很大的影響。選定實驗室常用的塑料、玻璃這2種材料的容器，并且底面積和高度都相似的250 mL燒杯作為容器進行實驗，。不同材料對蛋白提取率的影響試驗結(jié)果見圖4。由圖4 可以看出，用塑料杯的容器的蛋白提取率高，效果優(yōu)于玻璃杯容器，且兩者之間差異顯著(P ＜0.05)。推測原因是燒杯的材質(zhì)對超聲波的空化作用和能量的反射與吸收作用有一定的影響，從而影響到了超聲效果［15］。其作用機理目前還不清楚，有待深入去研究。

圖4 超聲材料對蛋白質(zhì)提取率的影響Fig.4 Effect of ultrasonic material on protein extraction rate

2.2 響應面試驗結(jié)果分析

2.2.1 回歸方程的建立與方差分析

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，以超聲功率、提取溫度、時間為自變量，蛋白提取率為響應(y)，自變量因素及編碼水平見表2，在單因素試驗基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken 設計三因素三水平試驗，試驗方案及結(jié)果見表3。

表2 試驗因素水平及編碼表Table 2 Variables and experimental design levels for response surface

表3 響應曲面試驗設計及結(jié)果Table 3 Experimental designs and extraction results

對表3 中的試驗結(jié)果進行回歸分析，得到金針菇根蛋白提取率(Y)與超聲功率(A)、超聲溫度(B )和超聲時間(C )3 個因素的數(shù)學回歸模型:

Y= +72.78 +1.21 A -1.50B -0.70C -3.29AB+1.92AC+0.23BC -3.52A2-9.21B2-3.31C2。對該模型進行顯著性檢驗，回歸模型系數(shù)顯著性檢驗，結(jié)果見表4。

表4 回歸模型的方差分析Table 4 ANOVA for Response Surface Quadratic Model

由表4 可知，該模型的F 值為11.38，表明該模型有意義且達到極顯著水平(P ＜0.01)。其中決定系數(shù)R2為0.936 0，說明該模型的擬合性較好，可用此模型對蛋白的提取率進行預測和分析。其中其信噪比大于4 即可認為該模型可用，而本模型的信噪比達到8.892，說明該模型可以在生產(chǎn)當中應用。

分析回歸模型系數(shù)顯著性得知AB，A2，B2，C2這幾項為顯著性的模型項。由F 檢驗可以得到因子貢獻率為:B ＞A ＞C，即溫度＞功率＞時間。

2.2.2 單因素效應分析

為進一步分析試驗中各因素對蛋白提取率的影響，對回歸模型進行降維處理。固定任意2 個因素于零水平，依次得到各個單因素與蛋白提取率的效應方程，根據(jù)方程可得到單因素效應曲線如圖5。

圖5 單因素效應分析圖Fig.5 Domino effect analysis of single factor

由圖5 可知，各因素對蛋白提取率的影響均呈先增大后減小的趨勢，其中B 超聲溫度變化幅度最大，說明超聲溫度對蛋白提取率影響最大。圖中各曲線的變化趨勢與前面單因素試驗結(jié)果基本吻合，說明所建立的數(shù)學模型是合適的。

2.2.3 交互作用分析

由方差分析結(jié)果可知，模型中AC，BC 無明顯的交互作用，AB 的交互作用顯著，即超聲功率和溫度之間的交互作用對蛋白提取率有顯著影響，其交互作用響應曲面和等高線如圖6 所示。

由圖6 可以得出，在超聲功率與溫度對總蛋白提取率的交互影響中，一定的超聲功率下，隨著提取溫度的升高，蛋白的提取率明顯增大，在30℃達到最大值后隨溫度升高降低。而一定的提取溫度下，隨著提取功率提高能緩慢增加總蛋白的提取率，從圖6 還可以看出，橢圓形明顯，說明二者的交互作用顯著。

2.2.4 回歸模型驗證

圖6 超聲功率和溫度交互影響蛋白質(zhì)提取率的曲面圖及等高線圖Fig.6 Response surface plot and contour plot of the effect of ultrasonic power and temperature and their mutual interactions on the extraction rate of protein

由Design-Expert.8.05b 軟件對試驗模型進行典型性分析以得到提取金針菇菌根蛋白的最佳條件為:功率124.33W;溫度29.40℃;時間19.76 min 能獲得最佳提取率的理論值為73.02%。采取上述最優(yōu)條件進行試驗，同時考慮到實際操作的情況，將蛋白提取條件修正為料液超聲功率120W、溫度30℃、時間20 min，實測提取率為73.22%，相對偏差0.27%，可見該模型能較好地反映金針菇菌根蛋白質(zhì)提取條件。

3 結(jié)論

本試驗采用超聲波輔助堿提法提取金針菇菌根蛋白。超聲條件對菌根蛋白的提取率有明顯的影響，提取因子貢獻率為溫度＞功率＞時間。由回歸模型得出超聲輔助提取的最佳工藝條件為功率124.33W，溫度29.40℃，時間19.76 min，能獲得最佳提取率的理論值為73.02%，通過驗證實驗實際提取率為73.22%，相對偏差為0.27%，證實了該模型的可靠行性，為金針菇根蛋白的提取提供了理論依據(jù)。

為了充分開發(fā)利用金針菇廢棄菌根，有效提高金針菇下腳料的價值仍需加大科研力度，完善蛋白提取分離的理論和方法，滿足工業(yè)產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的要求。采用超聲輔助提取金針菇根蛋白具有操作簡單，時間短，提取率高，能耗低等優(yōu)點，可以廣泛用于工業(yè)上蛋白的生產(chǎn)。

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