昆侖雪菊油樹脂精油成分分析及抑菌活性

迪里努爾· 阿布都熱合曼，敬思群，吳珊

(新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，新疆 烏魯木齊，830046)

新疆昆侖雪菊，學(xué)名為兩色金雞菊(Coreopsis tinctoria)，是菊科金雞菊屬1 年生草本植物的干燥頭狀花序，在新疆主要分布于和田地區(qū)海拔高3 000 米左右的昆侖山區(qū)，野生資源較豐富，對高血壓、高血脂、高血糖、冠心病等具有特殊療效［1］。目前，有研究［2］已從昆侖雪菊中分離鑒定出20 余類化學(xué)成分、300 多種天然成分，主要研究集中在昆侖雪菊化學(xué)成分分析［3-4］、提取物活性［5-8］，但是有關(guān)昆侖雪菊油樹脂精油成分與其抑菌作用的研究還未見報道。精油是天然產(chǎn)物中生物活性的一類重要組分，應(yīng)用廣泛［9-11］，通常植物精油是用來制備香精、香水等。但近十多年的許多研究發(fā)現(xiàn)，精油成分具有強(qiáng)烈的抑制或殺死真菌等微生物的特性［12-13］。因此，本文通過GC-MS 分析了昆侖雪菊油樹脂精油化學(xué)成分，同時對昆侖雪菊油樹脂精油的體外抑菌性進(jìn)行研究，旨為昆侖雪菊清熱解毒、抗菌消炎功效提供試驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 主要材料和儀器

昆侖雪菊花(野生)，由新疆和田沙漠玫瑰有限責(zé)任公司提供;大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草桿菌、青霉、黑曲霉，均由生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院微生物實驗室提供;

HH-S2數(shù)顯恒溫水浴鍋，金壇市醫(yī)療儀器廠;PHS-3C 實驗室PH 計，上海虹益儀器儀表有限公司;DHG-9123A 型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海-恒科技有限公司;DZF-6050 型真空干燥箱，上海-恒科技有限公司;GMSX-280 手提式壓力蒸汽消毒器，北京市永光明醫(yī)療儀器廠;GHP-9050 隔水式恒溫培養(yǎng)箱，上海-恒科學(xué)儀器有限公司;SW-CJ-2FD 潔凈工作臺，上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;QP2010 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，上海-恒科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 昆侖雪菊油樹脂精油的制備

昆侖雪菊花干燥粉末→超臨界CO2萃取雪菊油樹脂→3 500 r/min 離心15 min→取上清液→昆侖雪菊油樹脂精油

超臨界CO2萃取條件:萃取時間為100 min、萃取溫度為45℃、萃取壓力為20 MPa、夾帶劑(無水乙醇)用量為150 mL、CO2流量為20 L/h。

1.2.2 昆侖雪菊油樹脂精油GC-MS 成分分析

1.2.2.1 甲酯化處理

吸取3 mL 昆侖雪菊油樹脂精油于試管中，加入5 mL 石油醚和乙醚(V/V =4∶3)混合溶液，加入0.5 moL/L 氫氧化鉀-甲醇溶液4 mL，振蕩，靜置10 ～15 min，加入蒸餾水，靜置分層，取上清液進(jìn)樣分析。

1.2.2.2 GC-MS 實驗條件

GC 條件:色譜柱DB-5 毛細(xì)管柱(30 mm ×0.25 mm×0.25 μm);程序升溫:初始溫度40℃，保持3 min，程序升溫10℃/min，升溫至210℃，保持2 min，程序升溫5℃/min，升溫至280℃，保持3 min。進(jìn)樣口溫度280℃，柱前壓43 kPa，載氣氮氣，進(jìn)樣量0.5 μL，分流比20∶1，載氣流速1 mL/min。

MS 條件:EI 離子源，源溫200℃，電子能量70 eV，連接器溫度230℃，質(zhì)量掃描范圍(m/z):30 ～500。

對昆侖雪菊油樹脂精油分離，檢測，對總離子流圖中的各峰經(jīng)質(zhì)譜掃描后得質(zhì)譜圖，將其經(jīng)計算機(jī)WILEY7. LIB 威利標(biāo)準(zhǔn)譜庫數(shù)據(jù)系統(tǒng)分析處理，確定樣品的組成。定量結(jié)果以GC 的峰面積計算，按峰面積歸一化法計算各組分相對百分含量。昆侖雪菊油樹脂精油脂肪酸被GC 分離的各成分用下面的線性升溫公式計算其KI 值［14］:

式中:n-正烷烴的碳原子數(shù);tx-被測物質(zhì)x 的保留時間，min;tn，tn+1-碳原子數(shù)相差為1 的正烷烴的保留時間(tn＜tx＜tn+1)，min。

1.2.3 昆侖雪菊油樹脂精油抑菌試驗

1.2.3.1 昆侖雪菊油樹脂精油抑菌試驗流程

制備菌懸液→倒平板→標(biāo)記→涂布法接種→吸附一定劑量化學(xué)藥劑的濾紙片貼平板→倒置培養(yǎng)觀察并測量抑菌圈的直徑→數(shù)據(jù)分析總結(jié)

1.2.3.2 培養(yǎng)基的制備

細(xì)菌培養(yǎng)用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基:稱取牛肉膏3.0 g，蛋白胨5 g，NaCl 2.5 g，瓊脂9 g，加蒸餾水定容至500 mL 煮沸，調(diào)pH 至7.0 ～7.2。

霉菌培養(yǎng)用馬鈴薯培養(yǎng)基:稱取馬鈴薯100 g、葡萄糖10 g、瓊脂10 g、pH 自然(約6.0)。馬鈴薯處理方法:馬鈴薯去皮，切成塊加水，煮沸30 min(注意火力的控制，可適當(dāng)補(bǔ)水)，用紗布過濾，濾液加糖，補(bǔ)足300 mL，裝入三角瓶滅菌。

1.2.3.3 菌懸液的制備

取受試細(xì)菌(霉菌)接種到牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基斜面，37℃培養(yǎng)18 ～24 h，取受試霉菌接種到馬鈴薯培養(yǎng)基斜面，28℃培養(yǎng)48 h，培養(yǎng)產(chǎn)生孢子用接種環(huán)挑菌或孢子至無菌水中。

取37℃下培養(yǎng)24 h 的細(xì)菌1 環(huán)(霉菌取28℃下培養(yǎng)48 h)，接于10 mL 的無菌水中，搖勻。得到1∶10菌液。再取1∶10 菌液1 mL 至9 mL 無菌水中，得1∶100菌液。繼續(xù)稀釋，制成每毫升105～106CFU菌懸液。然后各吸取0.3 mL 分別加入已滅菌冷卻的平面培養(yǎng)基中采用稀釋涂布平板法涂布均勻后培養(yǎng)(霉菌:28℃/48 h，細(xì)菌:37℃/24 h)。

1.2.3.4 提取物的稀釋液的制備

將樣品提取物用95% 溶劑依次稀釋成75%、50%、25%、12.5%、6.25%、3.125%、1.563% 等濃度。

1.2.3.5 濾紙片法測定昆侖雪菊油樹脂精油對細(xì)菌(霉菌)的抑菌活性

采用濾紙片法測定昆侖雪菊油樹脂對細(xì)菌(霉菌)的抑菌活性［15］。取滅菌培養(yǎng)皿，倒入10 mL 固體培養(yǎng)基，凝固作為底層，將l mL 菌懸液加入冷卻至50℃的培養(yǎng)基9 mL 中，并迅速混勻，趁熱倒5 mL 至培養(yǎng)皿，作為菌層。待菌層凝固，均勻放置依次浸潤200 μL 的0.03% 山梨酸鉀、95% 乙醇、75% 精油、50% 精油、25% 精油、12.5% 精油、6.25% 精油、3.125% 精油、1.563% 精油的滅菌濾紙片，其中0.03%山梨酸鉀和95%乙醇作為陽性對照樣，無菌生理鹽水作陰性對照。每皿做3 次重復(fù)，細(xì)菌培養(yǎng)皿置37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 ～24 h，霉菌培養(yǎng)皿置28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。

1.2.3.6 最低抑菌濃度(MIC)的測定

取100 μL 菌懸液(含菌量105～106CFU/mL)于平板中并涂布均勻，然后將培養(yǎng)基劃分成4 份，分別標(biāo)注質(zhì)量濃度為75%、50%、25%、12.5%、6.125%、3.125%、1.625%，取已滅菌干燥的濾紙片，貼于平板表面，每皿4 片，最后在紙片處加入相應(yīng)濃度的昆侖雪菊油樹脂精油稀釋液。培養(yǎng)條件同1.2.3.5，同時設(shè)置溶劑對照，菌落被完全抑制的提取物最低稀釋濃度即為該種物質(zhì)對受試菌的MIC。

2 結(jié)果與分析

2.1 昆侖雪菊油樹脂精油GC-MS 分析結(jié)果

表1 昆侖雪菊油樹脂精油GC/MS 分析結(jié)果Table 1 GC/MS analysis results of the Coreopsis oleoresin essential oil

序號 化合物名稱 含量/%序號 化合物名稱 含量/%6正己酸0.1248α-綠葉烯0.29 7月桂烯0.51491 -石竹烯0.34 8正己酸乙酯0.1350反式-α-香檸檬醇7.53 9L-香芹醇0.1151Α-姜黃烯0.64 104-甲基-1 -(1 -甲基乙基)二環(huán)［3.1.0］二脫氫己烷0.13522-氟-3-［1-羥基-2-(甲氨基)乙烷基］苯酚0.01 11鄰異丙基甲苯1.98531H-非那烯0.46 12苧烯53.3654(順)β-金合歡烯1.85 13苯乙酮0.1955異辛胺0.02 142，4-二甲基苯乙烯0.2956肉豆蔻酸0.12 15芳樟醇2.1957N-甲基-1-十八胺0.06 161，2-二羥基-3-環(huán)戊烯0.06584-氟安非他明;0.02 179-［2-［2-丁基環(huán)己烷］甲基］-環(huán)丙烷壬酸甲酯0.07593，7，11，15-四甲基已烯-1-醇(葉綠醇)0.16 181，5，5，6-四甲基-1，3 環(huán)己二烯0.1860N-甲基異丙基胺196-莰烯醇0.1761N-甲基異丙基胺0.02 204-乙?；?1-甲基-環(huán)己烯0.1462二十五烷2.65 21(1R，4R)-1-甲基-4-(1-甲基乙烯基)-2-環(huán)己烯-1-醇0.2663葉綠醇0.02 22左旋樟腦0.16642-氨基十三烷0.01 23馬鞭草烯基乙基醚0.1365(R)-(-)-1-環(huán)己基乙胺0.02 242-異丙基-5-甲基-4-己烯醛0.1166D-氨基丙醇25鄰甲基苯乙酮0.4367棕櫚酸1.64 26萘0.268棕櫚酸乙酯0.21 27L-紫蘇醇0.28692，3-二甲基十七烷0.14 285-甲基-2，3 -二氮雜雙環(huán)［2.2.1］庚-2 -烯0.44708-1＇-2＇＇-己基環(huán)丙烷基環(huán)丙烷基辛酸甲酯0.57 292-甲基-5-(1-甲基乙烯基)環(huán)己酮0.1171合金歡醇0.03 30菊油環(huán)酮0.1372亞油酸2.2 312-(4-甲基-3-環(huán)己烯基)丙醛0.43732-甲基十六醛0.13 322-甲基-5-(1-甲基乙烯基)-2-環(huán)己烯-1-醇0.08742-［［2-［(2-乙基環(huán)丙基)甲基］環(huán)丙基］甲基］環(huán)丙基辛酸甲酯0.25 332-異丙基-5-甲基茴香醚0.2675硬脂酸乙酯0.12 34L-香芹酮0.1976二十七烷0.21 35紫蘇醛0.2777二十一烷0.36 36(1，7，7-三甲基降冰片烷-2-YL)乙酸0.1278二十八烷4.04 37草蒿腦0.1179正三十烷1.15 382，5-二甲氧基-4-(甲基磺?；?苯丙胺0.01804-異丙基-1-甲基-2-環(huán)己烯-1-醇0.34 391，3-二甲基丁胺811-金剛烷乙胺4010-羥去甲替林0.0182異辛胺411R，4R，7R，11R-1，3，4，7-四甲基三環(huán)0.26833，3 -二甲基-4-(甲氨基)-2-丁酮42(+)-γ-古蕓烯4.1384羥基脲0.02

由表1 可知，以峰面積歸一化法分析各個組分的相對含量，從超臨界流體萃取的昆侖雪菊油樹脂精油中鑒定出84 種化合物，其中，含量最高的是苧烯，較高的是1，2-二羥基-3-環(huán)戊烯、鄰異丙基甲苯、(-)-乙酰基-L-酒石酸、L-香芹酮、(+)-γ-古蕓烯、反式-α-香檸檬醇、β-金合歡烯、葉綠醇、亞油酸、二十八烷、正三十烷、二十五烷。張彥麗等［8］通過GC-MS 對昆侖雪菊揮發(fā)油成分進(jìn)行了研究，鑒定出其主要成分也為苧烯(63.23%)，但采用的揮發(fā)油提取技術(shù)是蒸餾提取法，技術(shù)路線與本文沒有相同之處。

2.2 抑菌試驗結(jié)果分析

2.2.1 昆侖雪菊油樹脂精油對細(xì)菌和霉菌的抑制作用

由表2 可知，昆侖雪菊油樹脂精油對3 種細(xì)菌和2 種霉菌均有抑制作用。對細(xì)菌的抑制作用表明:金雞菊油樹脂精油對細(xì)菌的抑制作用均較強(qiáng)，且金雞菊油樹脂精油對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑制作用強(qiáng)于對枯草桿菌的抑制作用;對霉菌的抑制作用表明:金雞菊油樹脂精油對青霉的抑制作用明顯高于對黑曲霉的抑制作用。隨著提取物濃度的增加，其對所研究作用物的抑制作用相應(yīng)增強(qiáng)。

表2 昆侖雪菊油樹脂精油的抑菌作用Table 2 Antibacterial activity of the Coreopsis oleoresin essential oil

2.2.2 昆侖雪菊油樹脂精油對細(xì)菌和霉菌最低抑制濃度的測定

由表3 可知，昆侖雪菊油樹脂精油對大腸桿菌的最小抑菌濃度(MIC)值為25%，對金黃色葡萄球菌和枯草桿菌的MIC 值為50%和75%，對革蘭氏陽性菌的抑菌效果明顯優(yōu)于革蘭氏陰性菌。昆侖雪菊油樹脂精油青霉的MIC 值為50%;而黑曲霉的MIC 值為75%。昆侖雪菊油樹脂精油對不同菌的最低抑制濃度不同，但總體上對細(xì)菌的抑制最低濃度要低于真菌最低濃度。

表3 昆侖雪菊油樹脂精油的MIC 試驗結(jié)果Table 3 Result of MIC of the Coreopsis oleoresin essential oil

通過昆侖雪菊油樹脂精油成分分析結(jié)果，可以看出昆侖雪菊油樹脂精油中，含量較豐富的酯類:棕櫚酸乙酯、烷基辛酸甲酯、硬脂酸乙酯、乙酸橙花酯。因為化學(xué)結(jié)構(gòu)的差異，酯類物質(zhì)可能有抑制微生物的作用。

不同提取方法對油樹脂精油的MIC 也有很大影響。不同提取方法影響油樹脂精油的活性成分、純度及濃度，從而影響抑菌效果。該實驗采用超臨界流體萃取法提取油樹脂精油，易受萃取時間、萃取壓力等因素影響，其結(jié)果可能會造成精油活性成分析不全和有效成分流失。

3 結(jié)論

從昆侖雪菊油樹脂精油中共鑒定出84 個化合物，其中烯類(64.12%)、醇類(11.47%)、烷烴類(8.76%)、酸類(6.31%)、酯類(1.5%)，含量占總量的92.16 %。昆侖雪菊油樹脂精油對細(xì)菌、霉菌有一定的抑制效果。昆侖雪菊油樹脂精油對大腸桿菌的最小抑菌濃度(MIC)值為25%，對金黃色葡萄球菌、枯草桿菌、青霉和黑曲霉的MIC 值分別為50%、75%、50%和75%。

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