反復凍融和超聲協(xié)同作用破碎酵母細胞*

苑華寧，黃冬云，張暉，錢海峰，王立，齊希光

(江南大學食品學院，江蘇 無錫，214122)

近年中國啤酒工業(yè)迅速發(fā)展，成為啤酒產量最大的國家，2012 年啤酒產量達到4 900 萬kL，占全球產量的1 /4 。該行業(yè)的迅猛發(fā)展帶來了大量的廢棄酵母，啤酒酵母中含有大量的營養(yǎng)物質，50%左右的蛋白質，23% ～28%碳水化合物，6% ～8%核糖，2% B族維生素，1% 谷胱甘肽以及豐富的氨基酸、礦物質［1］，對酵母進行破碎，是綜合利用酵母的一種有效途徑。酵母細胞壁較厚，難以破碎［2-3］，目前破碎酵母細胞的方法主要有酶法破壁、化學法破壁、物理法破壁。酶法酶制劑較貴，酶解時間長;化學法對蛋白質的損傷較大，容易引起蛋白質變性;單一的物理方法(如微珠法、反復凍融法、高壓勻漿法、超聲波法)破壁效率低、能耗大［4-5］。

反復凍融法是較溫和的破壁方法，可以避免高溫對原料造成的營養(yǎng)損失、風味裂變等不良影響［6］。超聲波破碎是一種有效的、溫和的破碎細胞的方法，由于超聲引起空穴，液體會形成小氣泡，在氣泡發(fā)生空穴的破碎期間，大量聲能轉化成機械能，引起剪切梯度使細胞發(fā)生破裂［4］，目前已廣泛應用于微生物和植物細胞中核酸、蛋白質的提取［7-8］。啤酒酵母細胞壁厚難以破碎，要有效利用細胞中的營養(yǎng)成分必須對其進行破壁處理［9］，本研究以破壁率為指標，首次采用反復凍融法與超聲破碎法協(xié)同破碎酵母細胞，旨在提高酵母的破壁率，為進一步綜合利用酵母細胞提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

啤酒酵母，實驗室保藏;葡萄糖，國藥集團化學試劑有限公司;酵母膏，國藥集團化學試劑有限公司;蛋白胨，國藥集團化學試劑有限公司。

冷凍離心機，CR21GⅡ;超凈工作臺，蘇凈安泰二級生物安全柜BHC-1000ⅡA2;生物光學顯微鏡，Galen Ⅲ;超聲細胞粉碎儀，南京新辰生物科技有限公司;激光粒度分析儀，美國Microtrac 公司S3500 ;恒溫恒濕培養(yǎng)箱，SPX-150C 型;電子天平，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司AL104 ;pH 計DELTA320，上海分析儀器三廠;血球計數(shù)板，XB-K-25 血細胞計數(shù)板;高壓蒸汽滅菌鍋，YXQ-LS-SⅡ。

1.2 方法

1.2.1 酵母細胞培養(yǎng)

將酵母菌活化，接種于YPD 液體培養(yǎng)基中，在30℃、130 r/min 的培養(yǎng)箱中進行擴大培養(yǎng)20h，冷凍離心，滅菌去離子水洗滌3 次，離心取沉淀備用。

1.2.2 反復凍融法破壁參數(shù)的選擇

以酵母細胞的破壁率為指標，考察加水量和凍融次數(shù)對破壁效果的影響。

1.2.2.1 加水量的影響

設計7 個處理，分別噴加5%，10%，15%，20%，25%，30%，35%的無菌去離子水，慢速冷凍2 h，解凍1 h，如此反復凍融3 次。每個處理重復3 次。

1.2.2.2 凍融次數(shù)的影響

處理為噴加25%的無菌去離子水，分別凍融1、2、3、4、5、6 次，凍結2 h，解凍1 h，每個處理重復3 次。

1.2.2 超聲波法破壁參數(shù)的選擇

設定超聲輻射時間間隔為15 s，于冰浴中對酵母細胞進行超聲破碎。以破壁率為指標，考察超聲功率、超聲總時間、每次輻射時間、酵母濃度等因素對破壁效果的影響。

先進行單因素實驗，找出這4 個因素的影響規(guī)律和優(yōu)化范圍。由于當功率達到500、600 W 時，超聲產生的熱效應很明顯，有部分細胞發(fā)生炭化沉于底部，所以單因素試驗的超聲功率取400 W、超聲總時間取15 min、每次輻射時間取10 s、酵母濃度取20 mg/mL。

為了得到酵母細胞破壁率與4 因素之間的量化關系，在單因素試驗基礎上，以酵母細胞破壁率為考察指標，以L9(34)正交表進行4 因素3 水平的正交試驗。正交設計見表1。

表1 L9(34)正交因素水平表Tab.1 L9(34)level of orthogonal factors

1.2.3 反復凍融及超聲波協(xié)同作用對酵母細胞破壁率的影響

將反復凍融與超聲波破碎技術相結合，比較單獨作用與協(xié)同作用條件下酵母細胞的破壁率。協(xié)同作用條件:加水量25%，慢速冷凍2 h、解凍1 h，反復凍融4 次，超聲功率400 W，每次輻射時間11 s，超聲總時間14.5 min，酵母濃度20 mg/mL。

1.2.4 破壁率的計算

采用活菌顯微鏡直接計數(shù)法，參照郭衛(wèi)蕓［6］等人處理方法進行活菌計數(shù)。

其中，α 為酵母細胞的破壁率;M 為破壁前的酵母菌細胞數(shù);N 為破壁后的酵母菌細胞數(shù)。

1.2.5 酵母細胞形態(tài)的觀察

采用日立S-4800 掃描電子顯微鏡(SEM)進行觀察。測試樣品參照孫鎮(zhèn)平［10］等人的高倍掃描預處理改進方法進行處理。

1.2.6 酵母粒度檢測

利用激光粒度分析儀對破碎前后的酵母溶液進行粒度分布測試。

1.2.7 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)統(tǒng)計采用SPSS17.0 進行單因素方差分析及LSD 多重檢驗(P ＜0.05)，數(shù)值以均值± 標準差表示。

2 結果與分析

2.1 反復凍融法對酵母細胞破壁率的影響

2.1.1 加水量的影響

由圖1 可以看出酵母細胞的破壁率隨著加水量的增大呈現(xiàn)先增大后平緩的趨勢。在加水量為25%時破壁率達到了29.25%，加水量大于25%時，破壁率變化很小，可見加水量為25%時酵母細胞間隙幾乎被水分填充滿，使得反復凍融對酵母細胞的機械破壞作用幾乎達到最大。這與郭衛(wèi)蕓［6］等人有關文獻報道相比稍有提高，可能與酵母菌種、凍融解凍速度條件有關。

圖1 加水量對酵母細胞破壁效果的影響Fig.1 Effect of water on the broken ratio of brewer yeast cell walls

2.1.2 凍融次數(shù)的影響

由圖2 可以看出，酵母細胞的破壁率隨著凍融次數(shù)的增加而增加。凍融次數(shù)低于2 次時，破壁率較小，增加不是很明顯，這可能是由于破壁率小不易觀察。當反復凍融超過3 次時，破壁率超過了30%，這可能由于冰晶的反復作用使得細胞破裂容易觀察。當凍融4 次以后，破壁率增加趨于平緩。

圖2 凍融次數(shù)對酵母細胞破壁效果的影響Fig.2 Effect of freezing and thawing times on the broken ratio of brewer yeast cell walls

2.2 超聲場對酵母細胞破壁率的影響

2.2.1 超聲功率的影響

超聲功率和頻率是影響超聲場強度的主要因素，當頻率不變，功率較低時超聲依靠機械效應和穩(wěn)態(tài)空化效應使傳質邊界層減薄，一定程度上使粒子運動加速［11］，超聲功率增加時超聲在液體中的作用主要是通過激烈而短暫的瞬態(tài)空化效應完成的，高強度超聲產生的空化效應比低強度超聲時強得多，因此，功率越大超聲破碎程度越大［4］。由圖3 可以看出，隨著超聲功率的增大，酵母細胞的破壁率先增加后趨于平緩。當功率達到500、600W 時，超聲產生的熱效應很明顯，有部分細胞發(fā)生炭化沉于底部，因此選用的超聲功率為400W。

圖3 超聲功率對酵母細胞破壁效果的影響Fig.3 Effect of power on the broken ratio of brewer yeast cell walls

2.2.2 超聲總時間的影響

由圖4 可以看出，隨著超聲總時間的延長，酵母細胞的破壁率逐漸增加。這主要是由于能量具有累積效應，隨著超聲時間的延長，超聲穩(wěn)流振蕩及空化效應積累越多，有利于酵母細胞的破碎。然而，能量的不斷積累［12］，可引起超聲波的化學效應，即能量能將溶出的大分子打斷或使其變性，所以并非時間越長越好。綜合考慮，選取超聲的總時間為15 min。

圖4 超聲總時間對酵母細胞破壁效果的影響Fig.4 Effect of total time on the broken ratio of brewer yeast cell walls

2.2.3 每次輻射時間的影響

由圖5 可看出，酵母細胞的破壁率隨著每次超聲輻射時間的增加呈現(xiàn)先增加后基本不變的趨勢，當每次輻射時間達到10 s 時，破壁率達到最大，此后基本不變。超聲波的空化效應需要一定的時間來完成［11］，每次輻射時間較短，超聲空化時的機械效應較低，細胞壁破壞較少;當輻射時間達到10 s 時，空化效應產生的機械作用使得酵母細胞細胞壁破裂。

圖5 每次輻射時間對破壁效果的影響Fig.5 Effect of ultrasound duration of irradiation each time on the broken ratio of brewer yeast cell walls

2.2.4 酵母濃度的影響

由圖6 可以看出，隨著菌體濃度的增加酵母細胞的破壁率呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢。在濃度為20 mg/mL 時破壁率達到61.45%，此后隨著菌體濃度的增大，破壁率逐漸減小。由此可以推測，合理的酵母細胞濃度可以有效提高超聲破壁的效率，選取菌體濃度為20 mg/mL。

圖6 菌體濃度對酵母細胞破壁效果的影響Fig.6 Effect of yeast concentration on the broken ratio of brewer yeast cell walls

2.2.5 正交試驗結果

正交試驗結果如表2 所示，以表3 的方差分析為依據(jù)，選取超聲總時間作為誤差估計項，研究結果表明，B(超聲功率)和D(酵母菌濃度)對酵母細胞的破壁效果有顯著影響(P ＜0.05)。由極差分析可以看出影響酵母菌破壁效果的各種因素的主次關系為B(功率)＞D(菌體濃度)＞A(每次輻射時間)＞C(超聲總時間)。正交試驗結果結合K 值可知最佳破壁條件為B2D2A3C1，即超聲功率400W，每次輻射時間11 s，超聲總時間14.5 min，酵母濃度20 mg/mL。

表2 正交實驗結果Table 2 Orthogonal experimental results

表3 方差分析Table 3 Analysis of variance

2.3 反復凍融及超聲波協(xié)同作用對酵母細胞破壁率的影響

由表4 可看出，利用反復凍融與超聲破碎協(xié)同作用可使酵母細胞的破壁率達到89.31%，是反復凍融4 次單獨作用的2.4 倍，是超聲破碎單獨作用的1.5倍。劉曉永［13］等人的研究表明，研磨法的破壁率只有10.03%，超聲波法對釀酒酵母的破壁率只有76.36%，不能滿足研究的需要，珠磨機法的破壁效果良好，但設備需進口，較為昂貴。孫海翔［14］等人的研究表明，高壓均質法和高速分散法的破壁率在50% ～70%。反復凍融與超聲波協(xié)同作用破碎酵母細胞操作簡單、破壁率高，綜合比較發(fā)現(xiàn)協(xié)同作用是破碎酵母細胞的一種高效的方法。

2.4 酵母細胞形態(tài)結構的觀察

采用掃描電子顯微鏡(SEM)對破壁前后的酵母菌形態(tài)進行觀察，放大倍數(shù)為5.00K 時的圖像如圖7所示。從圖7 可以看出，破壁前酵母菌的形態(tài)比較完好，呈現(xiàn)顆粒狀的形態(tài)，經過破壁處理后大部分酵母菌細胞破裂，形態(tài)結構被破壞，呈現(xiàn)碎片的形態(tài)。

表4 3 種不同處理方法對酵母細胞破壁率的影響Table 4 Effect of three different treatment methods on the broken ratio of brewer yeast cell walls

圖7 破壁前后酵母菌的形態(tài)Fig.7 The morphology of yeast cells

2.5 酵母細胞粒度分布

由圖8 可以看出3 種方法處理前后酵母溶液的粒度分布的變化情況。破壁前酵母溶液的粒度分布如圖a 所示，該啤酒酵母的粒度分布比較窄，其中d0.1= 4.3 μm，d0.5=5.59 μm，d0.9=9.45 μm。反復凍融處理后酵母溶液的粒度分布如圖b 所示，經凍融后酵母溶液中約1/3 的酵母破碎，小顆粒的溶度有所增加，溶液顆粒分布變寬，其中d0.1= 0.076 μm，d0.5=2.713 μm，d0.9=4.47 μm。超聲破碎后酵母溶液粒度分布如圖c 所示，與b 圖相比小顆粒的濃度更大，說明破壁率比反復凍融的高，約3/5 的酵母破碎，破碎后的顆粒更小，其中d0.1= 0.049 μm，d0.5=2.144 μm，d0.9=4.21 μm。反復凍融和超聲破碎協(xié)同處理后酵母溶液的粒度分布如圖d 所示，超過4/5的酵母細胞被破碎，與其他2 種處理方法相比，破壁后溶液中的小顆粒分布更寬，其中d0.1=0.013 10 μm，d0.5=0.025 00 μm，d0.9=3.67 μm，說明絕大多數(shù)的酵母破壁成為碎片，協(xié)同處理破碎酵母的效率更高。

圖8 酵母溶液的粒度分布Fig.8 The particle size distribution of yeast solution

3 結論

反復凍融和超聲破碎協(xié)同作用是破碎啤酒酵母細胞的一種高效、溫和的處理的方法，該法能夠保持大分子物質的活性，為進一步綜合利用啤酒廢酵母提供了參考。通過試驗可以發(fā)現(xiàn)，反復凍融處理時，在加水量為25%、凍融4 次時破壁率達到37.75%;超聲破碎時，在超聲功率400W，每次輻射時間11 s，超聲總時間14.5 min，酵母濃度20 mg/ml 時破壁率達到61.45%;反復凍融和超聲協(xié)同處理后，酵母溶液的破壁率達到了89.31%，是反復凍融4 次單獨作用的2.4 倍，是超聲破碎單獨作用的1.5 倍。因此反復凍融和超聲波協(xié)同作用，是破碎啤酒酵母細胞壁的一種高效方法。

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