海洋膠原低聚肽的血管舒張和降膽固醇作用*

劉文穎，林峰，谷瑞增，魯軍，林單，蔡木易

(中國(guó)食品發(fā)酵工業(yè)研究院，北京市蛋白功能肽工程技術(shù)研究中心，北京，100015)

血管內(nèi)皮細(xì)胞舒張功能損傷是動(dòng)脈粥樣硬化、血栓性疾病及高血壓等的早期病變，以內(nèi)皮細(xì)胞所分泌的一氧化氮(NO)減少而致血管舒張功能降低為其主要特征［1-2］。NO 是目前所知最強(qiáng)的內(nèi)源性血管舒張因子，血管內(nèi)皮細(xì)胞可通過釋放NO 松弛血管平滑?。?-4］。因此，通過提高NO 的分泌量，可以起到促進(jìn)血管舒張的作用。體內(nèi)過多的膽固醇會(huì)引起血脂偏高，進(jìn)而誘發(fā)心腦血管疾病、老年癡呆癥、膽結(jié)石等疾?。?-6］。低密度脂蛋白受體(LDLR)和3-羥基-3-甲基戊二酸單酰輔酶A 還原酶(HMGCR)是膽固醇合成及轉(zhuǎn)運(yùn)過程中的重要調(diào)控因子。通過提高LDLR 基因的表達(dá)、降低HMGCR 基因的表達(dá)，可以抑制膽固醇的合成［7-9］。治療血管內(nèi)皮細(xì)胞舒張功能損傷或高膽固醇癥的藥物雖然效果顯著，但是長(zhǎng)期服用具有一定的副作用。例如，臨床治療高膽固醇癥的藥物能夠降低膽固醇的合成速率，達(dá)到降低血脂的目的，但也具有肝、腎功能損害等毒副作用［3］。因此，尋找天然安全、具有生理活性的物質(zhì)已成為當(dāng)今研發(fā)的一大熱點(diǎn)。

海洋膠原低聚肽是以深海鮭魚的魚皮為主要原料，采用生物酶解方法生產(chǎn)的低聚肽混合物。本中心前期的研究結(jié)果表明，海洋膠原低聚肽具有較高的蛋白質(zhì)含量(91.2%)，分子質(zhì)量大多為1 000 Da 以下(90.8%)，主要集中在132 ～576 Da(69.3%)［10］。目前，對(duì)海洋膠原低聚肽的血管舒張和降膽固醇作用方面的研究尚未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)以人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)和人肝癌細(xì)胞株HepG2 為模型，探討海洋膠原低聚肽對(duì)HUVEC 細(xì)胞中NO 分泌量以及對(duì)HepG2 細(xì)胞內(nèi)LDLR 及HMGCR 基因表達(dá)的影響，旨在闡明海洋膠原低聚肽的血管舒張活性和降膽固醇作用，為其開發(fā)和利用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料

海洋膠原低聚肽(以深海鮭魚的魚皮為原料，采用生物酶解方法制得的小分子肽類物質(zhì))，由北京中食海氏生物技術(shù)有限公司提供。

人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)、內(nèi)皮細(xì)胞專用培養(yǎng)基，北京清源浩生物科技有限公司;人肝癌HepG2細(xì)胞，由北京師范大學(xué)細(xì)胞增殖與調(diào)控教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供;DMEM 培養(yǎng)基，美國(guó)GIBCO 公司;胎牛血清，杭州四季青公司;總一氧化氮檢測(cè)試劑盒，碧云天生物技術(shù)研究所;Trizol，美國(guó)Invitrogen 公司;反轉(zhuǎn)錄試劑盒，日本Takara 公司;Taq PCR StarMix 試劑盒，北京GenStar Biosolutions 公司。

1.1.2 儀器

CO2恒溫培養(yǎng)箱，德國(guó)Heraeus 公司;CKX41 倒置相差顯微鏡，日本Olympus 公司;iMark 酶標(biāo)儀，美國(guó)Bio-Rad 公司;SmartSpec plus 核酸蛋白測(cè)定儀、MyCycler PCR 擴(kuò)增儀、Gel Doc XR 凝膠成像系統(tǒng)，美國(guó)BIO-RAD 公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

HUVEC 細(xì)胞培養(yǎng)于含2%胎牛血清的內(nèi)皮細(xì)胞專用培養(yǎng)基中，HepG2 細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基中，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。待細(xì)胞融合至培養(yǎng)皿的80%左右時(shí)，棄去培養(yǎng)液，用PBS 沖洗，加入適量0.25%胰蛋白酶消化，進(jìn)行傳代。取處于對(duì)數(shù)期、生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 海洋膠原低聚肽溶液制備及實(shí)驗(yàn)分組

用PBS 溶液將海洋膠原低聚肽干粉配制成濃度為100 g/L 的母液，經(jīng)0.22 μm 的微孔濾膜過濾后，放入-20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩Ｓ糜谘苁鎻埢钚詼y(cè)定的細(xì)胞分組為:(1)對(duì)照組;(2)3g/L 海洋膠原低聚肽實(shí)驗(yàn)組;(3)6 g/L 海洋膠原低聚肽實(shí)驗(yàn)組;(4)9 g/L 海洋膠原低聚肽實(shí)驗(yàn)組;(5)12 g/L 海洋膠原低聚肽實(shí)驗(yàn)組。用于降膽固醇活性測(cè)定的細(xì)胞分組為:(1)對(duì)照組;(2)2 g/L 海洋膠原低聚肽實(shí)驗(yàn)組;(3)4 g/L 海洋膠原低聚肽實(shí)驗(yàn)組;(4)6 g/L 海洋膠原低聚肽實(shí)驗(yàn)組;(5)8 g/L 海洋膠原低聚肽實(shí)驗(yàn)組。

1.2.3 NO 含量的檢測(cè)

將HUVEC 接種于96 孔板中，細(xì)胞濃度為2.5 ×104個(gè)/mL，每孔100 μL。待細(xì)胞融合后，吸除培養(yǎng)液，加入100 μL 無血清的內(nèi)皮細(xì)胞專用培養(yǎng)基，培養(yǎng)4 h 后，用不同濃度的海洋膠原低聚肽培養(yǎng)液處理細(xì)胞，同時(shí)設(shè)不加低聚肽的對(duì)照孔，每組6 個(gè)平行。分別于0、1 和2h 吸取培養(yǎng)液，使用總一氧化氮檢測(cè)試劑盒測(cè)定NO 含量。以KNO2為標(biāo)準(zhǔn)品，利用HUVEC細(xì)胞培養(yǎng)液將試劑盒中的10 mmol/L KNO2稀釋成2、5、10、20、50 μmol/L，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，參照試劑盒說明書測(cè)定培養(yǎng)液中的NO 含量。

1.2.4 反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)分析LDLR、HMGCR 基因表達(dá)的變化

1.2.4.1 引物設(shè)計(jì)

利用Primer Premier 5.0 軟件設(shè)計(jì)PCR 引物，引物均由美國(guó)Invitrogen 公司合成。PCR 上下游引物見表1，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GADPH)為內(nèi)參基因。

表1 PCR 引物Table 1 Primers used in PCR analysis

1.2.4.2 細(xì)胞總RNA 提取

將HepG2 細(xì)胞接種于6 孔板中，細(xì)胞濃度為約5 ×104個(gè)/mL，每孔3 mL。待細(xì)胞融合至60%后，吸除培養(yǎng)液，用PBS 沖洗，加入3 mL 不含血清的DMEM 培養(yǎng)基，用不同濃度的海洋膠原低聚肽培養(yǎng)液處理細(xì)胞，同時(shí)設(shè)不加低聚肽的對(duì)照孔，每組6 個(gè)平行。培養(yǎng)24h 后，用胰酶消化，3 000 g 離心2 min收集細(xì)胞，棄上清液。加入1 mL DEPC 水溶解，3 000 g 離心2 min，加入1 mL Trizol 裂解細(xì)胞，轉(zhuǎn)移到1.5 mL 離心管中，充分裂解后，加入0.2 mL 氯仿，12 000 g 離心15 s，取上清液，加入0.5 mL 異丙醇，室溫靜置20 min 后，12 000g 離心10 min，棄上清液，緩慢加入1 mL 75%乙醇洗滌，7 500 g 離心5 min，棄上清液，空氣風(fēng)干后加入20 μL DEPC H2O 溶解。利用核酸蛋白測(cè)定儀測(cè)定RNA 的濃度，取0.5 μg RNA 溶液用于RT-PCR 反應(yīng)，剩余RNA 溶液置于-80℃冰箱中保存。

1.2.4.3 cDNA 合成

20 μL 體系中含有5 × Prime Script? Butter 4 μL，Oligo dT Primer 1 μL，Random Primer 5 μL，dNTP Mixture 2 μL，RNase Inhibitor 0.5 μL，PrimeScript?RTase 2 μL，DEPC 水以及RNA 溶液共5.5 μL。反應(yīng)條件:25℃，10 min;42℃，60 min;4℃，∞。按反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行cDNA 合成，合成好的cDNA 置于4℃冰箱中保存待測(cè)。

1.2.4.4 RT-PCR 分析

20 μL 體系中含有重蒸水7 μL、2 × Taq PCR StarMix 10 μL、PCR 上游引物和下游引物混合溶液2 μL、反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物1 μL，充分混勻。反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性5 min，94℃變性30s，退火溫度53℃，30 s，72℃延伸30s 進(jìn)行35 個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 min 后4℃保存。取10 μL PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠成像系統(tǒng)上進(jìn)行分析，以目的基因條帶與GADPH 條帶密度比值表示相應(yīng)基因mRNA 的相對(duì)表達(dá)水平，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用ˉx±s 表示，采用SPSS 13.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，組間比較采用t 檢驗(yàn)，P ＜0.05，兩者有顯著性差異;P ＜0.01，兩者有極顯著性差異。

2 結(jié)果與討論

2.1 海洋膠原低聚肽的血管舒張作用

2.1.1 NO 檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)曲線

NO 是由血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生的內(nèi)皮衍生因子，是目前所知最強(qiáng)的內(nèi)源性血管舒張因子，具有明顯廣泛的擴(kuò)張血管作用，其生成減少或生物利用度的降低將導(dǎo)致血管阻力增加。血管舒張能力與產(chǎn)生NO 能力具有很強(qiáng)的相關(guān)性，一定量的NO 水平是重要的內(nèi)源性細(xì)胞保護(hù)物質(zhì)［1-4］。因此通過測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)液中NO 的濃度即可表征樣品的血管舒張活性［11-12］。NO檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1 所示，標(biāo)準(zhǔn)品的吸光值隨著濃度的增大而增大，成正比關(guān)系，擬合曲線為y =0.004x-0.009 3(R2=0.998 8)。

圖1 NO 檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of determination of NO

2.1.2 海洋膠原低聚肽對(duì)HUVEC 分泌NO 的影響

結(jié)果見圖2。與對(duì)照組相比，各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞在海洋膠原低聚肽的作用下，NO 分泌量均有所增加，并且呈明顯的量效關(guān)系。海洋膠原低聚肽濃度為6 g/L時(shí)，NO 分泌量顯著性增加(P ＜0.05)，濃度為9 g/L、12 g/L 時(shí)，NO 分泌量極顯著性增加(P ＜0.01)。濃度為12 g/L 時(shí)，NO 含量增加最多。此外，由圖2 可知，不同濃度海洋膠原低聚肽作用2 h 后，NO 分泌量均比作用1h 有所降低。本項(xiàng)研究結(jié)果表明，海洋膠原低聚肽能顯著提高NO 含量，提示其具有調(diào)節(jié)血管舒縮功能、保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞的作用。

圖2 不同濃度海洋膠原低聚肽作用下HUVEC 的NO分泌量，與對(duì)照組相比，* P ＜0.05，＊＊ P ＜0.01Fig.2 The secretion of NO in HUVEC treated by different concentration of MCOP. Compared with the control，* P ＜0.05，＊＊ P ＜0.01

Hirota 等［13］對(duì)2 種三肽VPP(Val-Pro-Pro)和IPP(Ile-Pro-Pro)的血管舒張作用進(jìn)行了研究，結(jié)果表明2 種肽段在濃度為0.01 mmol/L 時(shí)，能顯著促進(jìn)NO 分泌，提高NO 含量。本研究中的海洋膠原低聚肽是小分子肽的混合物，經(jīng)分離純化后，可富集血管舒張活性高的肽段，明確對(duì)海洋膠原低聚肽的血管舒張活性起主要作用的肽段。

研究表明，肽的血管舒張活性與其ACE(血管緊張素轉(zhuǎn)化酶)抑制活性有一定的相關(guān)性，肽可通過輔助血管舒緩激肽起到ACE 抑制作用，通過B2 受體促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞中NO 的分泌，從而起到舒張血管的作用［13］。Hirota 等的研究中便對(duì)VPP 和IPP 的兩種活性之間的相關(guān)性進(jìn)行了探討。本中心前期已對(duì)海洋膠原低聚肽的ACE 抑制活性進(jìn)行了研究，證實(shí)了其具有較強(qiáng)的ACE 抑制活性(半抑制濃度IC50值=1.165 ±0.087 mg/mL)［10］。關(guān)于海洋膠原低聚肽的血管舒張活性的作用機(jī)制需要進(jìn)一步的研究。

2.2 海洋膠原低聚肽的降膽固醇作用

低密度脂蛋白受體(LDLR)和3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A 還原酶(HMGCR)是膽固醇合成及轉(zhuǎn)運(yùn)過程中的重要調(diào)控因子。LDLR 是一種跨膜糖蛋白，具有維持血漿膽固醇水平恒定的作用。LDLR 減少，會(huì)導(dǎo)致血漿中低密度脂蛋白(LDL)攝取減少，進(jìn)而導(dǎo)致血漿中LDLR 水平升高，使血膽固醇水平升高［14-15］。HMGCR 是膽固醇合成的限速酶，是膽固醇代謝的最重要的酶之一，能夠催化3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A(HMG-CoA)還原生成甲羥戊酸，是整個(gè)膽固醇合成過程中的限速步驟［16］。因此，可通過增強(qiáng)LDLR 基因表達(dá)和降低HMGCR 基因表達(dá)，降低血膽固醇水平［17-18］。

本研究結(jié)果顯示，對(duì)HepG2 細(xì)胞分別加入2、4、6、8 g/L 海洋膠原低聚肽培養(yǎng)24h 后，與對(duì)照組比較，除2 g/L 海洋膠原低聚肽組外，其他實(shí)驗(yàn)組的LDLR表達(dá)量均有上調(diào)(圖3 和圖4)。

圖3 海洋膠原低聚肽對(duì)HepG2 細(xì)胞LDLR、HMGCR mRNA 水平的影響Fig.3 The influence of MCOP on LDLR and HMGCR mRNA levels in HepG2 cells

圖4 海洋膠原低聚肽對(duì)HepG2 細(xì)胞LDLR mRNA相對(duì)表達(dá)水平的影響，與對(duì)照組相比，* P ＜0.05，＊＊ P ＜0.01Fig.4 The influence of MCOP on the relative expression level of LDLR mRNA in HepG2 cells. Compared with the control，* P ＜0.05，＊＊ P ＜0.01

4 g/L 海洋膠原低聚肽組的LDLR mRNA 表達(dá)增加最多，呈極顯著性差異(P ＜0.01)，是對(duì)照組的2.6倍。6 g/L、8 g/L 海洋膠原低聚肽組的LDLR mRNA表達(dá)顯著性增加(P ＜0.05)，分別是對(duì)照組的1.5、1.7 倍。各濃度海洋膠原低聚肽培養(yǎng)24 h 后，與對(duì)照組比較，HMGCR 的表達(dá)量均有下調(diào)，并有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(圖3、圖5)。2 g/L 海洋膠原低聚肽組的HMGCR mRNA 表達(dá)顯著性降低(P ＜0.05)，其余3 組的HMGCR mRNA 表達(dá)極顯著性降低(P ＜0.01)，其中6 g/L 海洋膠原低聚肽組的HMGCR mRNA 表達(dá)最低，大約降低了3/5。本研究結(jié)果表明，海洋膠原低聚肽能上調(diào)HepG2 細(xì)胞內(nèi)LDLR mRNA 水平，下調(diào)HMGCR mRNA 水平，提示海洋膠原低聚肽可通過增強(qiáng)LDLR 的表達(dá)、抑制HMGCR 酶活性來降低細(xì)胞膽固醇合成。

圖5 海洋膠原低聚肽對(duì)HepG2 細(xì)胞HMGCR mRNA相對(duì)表達(dá)水平的影響，與對(duì)照組相比，* P ＜0.05，＊＊ P ＜0.01Fig.5 The influence of MCOP on the relative expression level of HMGCR mRNA in HepG2 cells. Compared with the control，* P ＜0.05，＊＊ P ＜0.01

近年的研究表明，LDLR 和HMGCR 的表達(dá)是通過固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白(SREBP)途徑調(diào)節(jié)的。在此途徑中，包括多個(gè)影響LDLR 和HMGCR 表達(dá)的因子和調(diào)控環(huán)節(jié)［19］。因此，海洋膠原低聚肽很可能通過SREBP 通路調(diào)控系統(tǒng)誘導(dǎo)LDLR 和HMGCR 基因表達(dá)，具體通過哪個(gè)因子、哪個(gè)環(huán)節(jié)進(jìn)行調(diào)控，還有待進(jìn)一步研究。

目前，關(guān)于肽類物質(zhì)對(duì)膽固醇代謝影響的研究較少，現(xiàn)有的報(bào)道中大多是對(duì)植物提取物的相關(guān)研究，如Salleh 等［20］研究了多種從食用植物中提取的多酚物質(zhì)對(duì)HepG2 細(xì)胞膽固醇代謝的影響，發(fā)現(xiàn)12 種多酚物質(zhì)具有調(diào)節(jié)LDLR 表達(dá)的作用。本研究明確了海洋膠原低聚肽在調(diào)節(jié)膽固醇代謝方面的影響，為其開發(fā)利用提供了一定的理論依據(jù)。

3 結(jié)論

通過測(cè)定HUVEC 細(xì)胞培養(yǎng)液中NO 含量的變化，對(duì)海洋膠原低聚肽的血管舒張活性進(jìn)行了研究。結(jié)果顯示，各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞在海洋膠原低聚肽的作用下，NO 分泌量均有所增加，并且呈明顯的量效關(guān)系。濃度為12 g/L 時(shí)，NO 含量增加最多。不同濃度海洋膠原低聚肽作用2 h 后，NO 分泌量均比作用1h 有所降低。結(jié)果表明，海洋膠原低聚肽能顯著提高NO 含量，提示其具有調(diào)節(jié)血管舒縮功能、保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞的作用。

通過觀察HepG2 細(xì)胞中LDLR 和HMGCR 表達(dá)的變化，對(duì)海洋膠原低聚肽的降膽固醇作用進(jìn)行了研究。結(jié)果顯示，海洋膠原低聚肽培養(yǎng)24 h 后，除2 g/L 海洋膠原低聚肽組外，其他實(shí)驗(yàn)組的LDLR 表達(dá)量均有上調(diào)，其中4 g/L 海洋膠原低聚肽組的LDLR 表達(dá)量增加最多;各實(shí)驗(yàn)組HMGCR 的表達(dá)量均有下調(diào)，其中6 g/L 海洋膠原低聚肽組的HMGCR 表達(dá)量最低。結(jié)果表明，海洋膠原低聚肽能上調(diào)HepG2 細(xì)胞內(nèi)LDLR mRNA 水平，下調(diào)HMGCR mRNA 水平，提示海洋膠原低聚肽具有降低細(xì)胞膽固醇合成的作用。

通過對(duì)海洋膠原低聚肽的血管舒張活性和降膽固醇活性的研究，為其開發(fā)利用提供了理論依據(jù)，但關(guān)于海洋膠原低聚肽中特征性活性肽段的進(jìn)一步分離純化、鑒定以及促進(jìn)血管舒張和降膽固醇的作用機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。

［1］ 楊菊紅，王楠，李京艷，等. 白藜蘆醇對(duì)高脂處理人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞SIRT1 表達(dá)、eNOS 活性及NO 分泌的影響［J］. 中國(guó)藥房，2009，20(13):981 -983.

［2］ Lüscher T F.Imbalance of endothelium-derived relaxing and contracting factors:A new concept in hypertension［J］.Am J Hypertens，1990，3(4):317 -330.

［3］ Huang P L，Huang Z，Mashimo H，et al. Hypertension in mice lacking the gene for endothelial nitric oxide synthase［J］. Nature，1995，377:239 -242.

［4］ Vanhoutte P M. Endothelium and control of vascular function. state of the art lecture［J］. Hypertension，1989，13(6):658 -667.

［5］ 賈連群，楊關(guān)林，羅瑩，等. 化淤祛痰方及其拆方對(duì)HepG2 細(xì)胞膽固醇代謝的影響及其機(jī)制研究［J］. 中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2012，18(16):158 -162.

［6］ 賈連群，楊關(guān)林，羅瑩，等. 化淤祛痰方藥含藥血清對(duì)HepG2 細(xì)胞膽固醇代謝相關(guān)基因表達(dá)的影響［J］. 時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2012，23(1):127 -129.

［7］ 吳瓊，王世聰，馬俊鋒，等. 超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用法快速篩選3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A 還原酶抑制劑［J］. 化學(xué)分析，2013，41(7):1 013 -1 018.

［8］ 湯世國(guó)，李伶，楊剛毅，等. 高脂誘導(dǎo)胰島素抵抗apoE-/-小鼠HMGCR、SREBP-2 和LDLr 基因表達(dá)的變化［J］. 中國(guó)糖尿病雜志，2009，20(4):292 -294.

［9］ 汪曉紅，范竹萍，邱德凱，等. 脂肪變性肝細(xì)胞膽固醇代謝及合成相關(guān)基因的表達(dá)［J］. 上海交通大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，27(9):1 111 -1 114.

［10］ Gu R Z，Li C Y，Liu W Y，et al. Angiotensin I-converting enzyme inhibitory activity of low -molecular -weight peptides from Atlantic salmon (Salmo salar L. )skin［J］.Food Res Int，2011，44(5):1 536 -1 540.

［11］ Lekakis J，Papamicheal C，Stamatelopoulos K，et al. Hemochromatosis associatet with endothelial dysfunction:evidence for the role of iron stores in early atherogenesis［J］. Vasc Med，1999，4(3):147 -148.

［12］ Heitzer T，Schlinzig T，Krohn K，et al.Endothelial dysfunction，oxidative stress，and risk of cardiovascular events in patients with coronary artery disease［J］. Circulation，2001，104:2 673 -2 678.

［13］ Hirota T，Nonaka A，Matsushita A，et al.Milk casein-derived tripeptides，VPP and IPP induced NO production in cultured endothelial cells and endothelium-dependent relaxation of isolated aortic rings［J］. Heart Vessels，2011，26(5):549 -556.

［14］ Benn M，Nordestgaard B G，Jensen J S，et al.Mutation in apolipoprotein B associated with hypobetalipoproteinemia despite decreased binding to the LDL receptor［J］.J Biol Chem，2005，280(22):21 052 -21 060.

［15］ Yu-Poth S，Yin D，Zhao G，et al.Conjugated linoleic acid upregulates LDL receptor gene expression in HepG2 cells［J］.J Nutr，2004，134(1):68 -71.

［16］ 湯世國(guó)，李伶，楊剛毅，等. 高脂誘導(dǎo)胰島素抵抗apoE-/-小鼠HMGCR、SREBP-2 和LDLr 基因表達(dá)的變化［J］. 中國(guó)糖尿病雜志，2009，20(4):292 -294.

［17］ 吳瓊，王世聰，馬俊鋒，等. 超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用法快速篩選3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A 還原酶抑制劑［J］. 化學(xué)分析，2013，41(7):1 013 -1 018.

［18］ 汪曉紅，范竹萍，邱德凱，等. 脂肪變性肝細(xì)胞膽固醇代謝及合成相關(guān)基因的表達(dá)［J］. 上海交通大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，27(9):1 111 -1 114.

［19］ 竇曉兵，沃興德，范春雷，等. 姜黃素對(duì)人肝細(xì)胞HepG2 中低密度脂蛋白受體基因表達(dá)影響的研究［J］. 中國(guó)藥學(xué)雜志，2007，42(8):572 -575.

［20］ Salleh M N. Inhibition of low-density lipoprotein oxidation and up-regulation of low-density lipoprotein receptor in HepG2 cells by tropical plant extracts［J］.J Agric Food Chem，2002，50(13):3 693 -3 697.