重組小鼠IFN－β原核表達(dá)載體的構(gòu)建及包涵體溶解條件的篩選

蘇雅拉圖，張永勝，陳宇杰，胡小平，王麗穎，萬 敏，吳柒柱

（1.內(nèi)蒙古民族大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古 通遼 028000；2.吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室 ，吉林 長春 130021）

干擾素β（interferon－β，IFN－β）具有廣泛的抗病毒作用，對(duì)一般病毒感染有促進(jìn)機(jī)體恢復(fù)及縮短病程的作用［1－2］。IFN－β對(duì)某些癌細(xì)胞有抑制作用，可下調(diào)細(xì)胞原癌基因的轉(zhuǎn)錄水平，下調(diào)某些生長因子受體表達(dá)［3］，對(duì)巨噬細(xì)胞的功能有增進(jìn)作用，并可調(diào)節(jié)T、B淋巴細(xì)胞的功能［4］。利用基因工程下游技術(shù)可以在大腸桿菌中表達(dá)IFN－β，但表達(dá)產(chǎn)物往往是以包涵體形式存在，要通過變復(fù)性過程才可以獲得有活性的IFN－β。一些文獻(xiàn)［5－6］報(bào)道：在研究中存在包涵體無法溶解或溶解效率低的問題。本文作者主要在重組小鼠IFN－β原核表達(dá)載體的構(gòu)建及包涵體溶解效率等技術(shù)方面做了嘗試，以期為篩選適合包涵體溶解的條件提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物和主要試劑

Balb／c鼠（昆明鼠）購自吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。內(nèi)切酶NcoⅠ、HindⅢ和T4DNA連接酶、pMD18－T質(zhì)粒購自寶生物工程有限公司（大連）；Taq DNA聚合酶購自Promega公司；DNA回收試劑盒購自北京鼎國生物技術(shù)公司；IPTG購自Sigma公司；pET－28a（＋）質(zhì)粒購于美國Novagen公司；JM109菌種和BL21（DE3）菌種由吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 引物的設(shè)計(jì)

采用primer 5.0軟件設(shè)計(jì)引物。上游引物，5＇－CCATGG（NcoⅠ酶切位點(diǎn)）GA（調(diào)解堿基錯(cuò)位）ATCAACTATAAGCAGCTC－3′；下游引物，5′－G（調(diào)解 GC比）AAGCTT（HindⅢ酶切位點(diǎn)）GTTTTGGAAGTTTCTGGT－3′，由上海生工生物技術(shù)公司合成。

1.3 重組表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定

采用新鮮小鼠肝組織提取DNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，電泳回收片段，T－A克隆pMD18－T質(zhì)粒。將重組pMD18－T質(zhì)粒轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)細(xì)胞，菌液移入培養(yǎng)基中，置37℃恒溫箱中過夜。從氨芐青霉素（Amp）抗性LB固體培養(yǎng)基中挑單菌落接種于含5mL LB液體培養(yǎng)基（Amp：75mg·L－1）試管中，37℃、175r·min－1振蕩培養(yǎng)過夜。堿溶解法小量制備質(zhì)粒，由限制性內(nèi)切酶NcoⅠ和HindⅢ雙酶切，電泳，能釋放出目的片段的質(zhì)粒為陽性克隆?；厥漳康钠?，同時(shí)將PET28a空質(zhì)粒NcoⅠ和HindⅢ雙酶切回收。在T4DNA連接酶的作用下將目的片段定向克隆至雙酶切的PET28a空質(zhì)粒中，后將其轉(zhuǎn)化到BL21表達(dá)工程菌。菌液移入KaNa抗性LB固體培養(yǎng)基中，37℃恒溫箱中過夜培養(yǎng)。從KaNa抗性LB固體培養(yǎng)基中挑單菌落接種于含5mL LB液體培養(yǎng)基（Amp：75mg·L－1）試管中，37℃、175r·min－1振蕩培養(yǎng)過夜。堿溶解法小量制備質(zhì)粒，限制性內(nèi)切酶NcoⅠ和HindⅢ雙酶切，產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠中電泳，能釋放出目的片段的質(zhì)粒為陽性克隆。陽性重組質(zhì)粒送上海生工公司測序。將重組IFN－β命名為IFN－β′，并利用 DNA star序列分析軟件分析IFN－β′成熟蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)、等電點(diǎn)及相對(duì)分子質(zhì)量。確定測序結(jié)果與GenBank登錄的小鼠IFN－β的序列信息相符后，用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，并SDS－PAGE鑒定。

1.4 目的蛋白包涵體溶解

菌液11000r·min－1離心10min，沉淀加入溶解液（Tirs 20mmol · L－1，NaCl 500mmol·L－1，尿素8mol·L－1，pH 7.8）攪拌均勻后4℃冰箱過夜。次日取混合液100μL，11000r·min－1離心10min，將沉淀和上清分離，沉淀加入100μL祛離子水混勻后，上清與沉淀各加5×非還原Buffer 25μL沸煮5min，離心。經(jīng)15%SDS－PAGE檢測。因IFN－β′蛋白以包涵體形式表達(dá)，所以在進(jìn)行此重組蛋白的復(fù)性和純化過程中要求先對(duì)包涵體進(jìn)行溶解。傳統(tǒng)方法溶解IFN－β′蛋白包涵體，以1g菌∶5mL溶解液混勻，超聲波破菌（工作5s，間隔5s，60次），4℃過夜，次日15%SDS－PAGE檢測。本研究對(duì)比了不同溶解液成分、不同pH環(huán)境、不同干菌與溶｀解液比例、不同溶解溫度、不同溶解時(shí)間等主要因素對(duì)包涵體溶解效果的影響。同時(shí)觀察不同包涵體洗滌液對(duì)包涵體溶解效果的影響（洗滌液1：Tris 50mmol·L－1，pH 7.8； 洗滌液2：Tris 50mmol·L－1，尿素2mol·L－1，TritonX－1001／50，pH 7.8）。

2 結(jié) 果

2.1 IFN－β′成熟蛋白預(yù)測與鑒定

利用DNA star預(yù)測到IFN－β′成熟蛋白的等電點(diǎn)（pI）為9.67，相對(duì)分子質(zhì)量為21300。重組蛋白氨基酸序列中含有1個(gè)半胱氨酸。用限制性內(nèi)切酶NcoⅠ和HindⅢ雙酶切重組質(zhì)粒pET／IFN－β，1%瓊脂糖電泳顯示在486bp處有條帶產(chǎn)生，證明IFN－β基因插入 pET－28a（＋）質(zhì)粒的 NcoⅠ 和HindⅢ酶切位點(diǎn)間。見圖1。

圖1 雙酶切pET－28a的瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.1 Agarose gel electrophoregram of pET－28adigested by enzyme

2.2 IFN－β′的誘導(dǎo)表達(dá)

用相同濃度IPTG誘導(dǎo)不同時(shí)間（圖2A）及不同IPTG濃度誘導(dǎo)相同時(shí)間（圖2B）對(duì)目的蛋白表達(dá)量均有影響。目的蛋白表達(dá)量與誘導(dǎo)時(shí)間有關(guān)；由于IPTG可循環(huán)使用，且0.06～0.40mmol·L－1的IPTG濃度所表達(dá)的產(chǎn)量基本相同，為了減少IPTG對(duì)菌體的傷害，并且考慮操作方便，在實(shí)驗(yàn)中用0.1mmol·L－1IPTG誘導(dǎo)。

2.3 IFN－β′蛋白的可溶性表達(dá)

應(yīng)用超聲方法裂解經(jīng)0.1mmol·L－1IPTG誘導(dǎo)的E.coli菌體，檢測是否有可溶性的IFN－β′蛋白表達(dá)。SDS－PAGE分析顯示：IFN－β′蛋白不以可溶性形式表達(dá)（圖3A）。改變誘導(dǎo)條件為18℃、150r·min－1過夜誘導(dǎo)12h，SDS－PAGE分析顯示：IFN－β′蛋白仍然以包涵體形式表達(dá)（圖3B）。

2.4 不同條件下包涵體溶解效果

2.4.1 傳統(tǒng)方法溶解包涵體蛋白 用傳統(tǒng)方法溶解IFN－β′蛋白包涵體后，SDS－PAGE分析顯示：IFN－β′蛋白不能被溶解。見圖4。

圖2 表達(dá)產(chǎn)物的SDS－PAGE電泳圖Fig.2 SDS－PAGE electrophoregram of expression product

圖3 可溶性IFN－β′蛋白表達(dá)的SDS－PAGE電泳圖Fig.3 SDS－PAGE electrophoregram of soluble IFN－β′protein expression

2.4.2 使用不同pH值溶解液包涵體蛋白溶解情況 改變?nèi)芙庖簆H值溶解IFN－β′蛋白包涵體，SDS－PAGE檢測結(jié)果顯示：改變包涵體溶解液pH值對(duì)IFN－β′蛋白包涵體的溶解無明顯影響。見圖5。

2.4.3 溶解液中加入DTT時(shí)包涵體蛋白溶解情況 在溶解液中加入DTT溶解IFN－β′蛋白包涵體，SDS－PAGE檢測結(jié)果顯示：溶解液中加入DTT對(duì)IFN－β′蛋白包涵體的溶解無明顯影響。見圖6。

圖4 包涵體溶解SDS－PAGE電泳圖Fig.4 SDS－PAGE electrophoregram of dissolved inclusion body

圖5 不同pH值溶解液溶解包涵體的SDS－PAGE電泳圖Fig.5 SDS－PAGE electrophoregram of lysis inclusion body in solutions with different pH values

圖6 溶解液中加入DTT后SDS－PAGE電泳圖Fig.6 SDS－PAGE electrophoregram of lysis precipitation added with DDT

2.4.4 包涵體洗滌后溶解效果 為防止菌體碎片對(duì)溶解液溶解包涵體產(chǎn)生影響，裂解包涵體前使用包涵體洗滌液進(jìn)行洗滌，純化的包涵體再經(jīng)溶解液溶解，SDS－PAGE檢測結(jié)果顯示：包涵體經(jīng)洗滌后不能被溶解液所溶解。見圖7。

圖7 包涵體洗滌后溶解SDS－PAGE電泳圖Fig.7 SDS－PAGE electrophoregram of the inclusion body after washing and dissolving

2.4.5 尿素溶解液溶解包涵體SDS－PAGE檢測結(jié)果 因采用8mol·L－1尿素不能溶解IFN－β′蛋白包涵體，因此嘗試用10mol·L－1尿素的溶解液來裂解蛋白包涵體，SDS－PAGE檢測結(jié)果顯示：含有10mol·L－1尿素濃度的溶解液亦不能溶解此包涵體。見圖8。

圖8 10mol·L－1尿素溶解液溶解包涵體SDS－PAGE電泳圖Fig.8 SDS－PAGE electrophoregram of inclusion body dissolved with 10mol·L－1 urea solution

2.4.6 使用不同比例溶解液包涵體蛋白溶解情況

考慮到溶解包涵體蛋白濃度和溫度對(duì)包涵體的溶解有一定影響，因此嘗試增加溶解液的比例，溶解液比例增加至1g菌∶20mL溶解液，并且分別在室溫和37℃溫度下觀察包涵體溶解情況，SDSPAGE檢測結(jié)果顯示：溫度對(duì)包涵體溶解幾乎無影響，而增加溶解液比例能溶解部分IFN－β′蛋白包涵體。見圖9。

圖9 不同比例溶解液溶解包涵體SDS－PAGE電泳圖Fig.9 SDS－PAGE electrophoregram of inclusion body dissolved with different proportions of solution

3 討 論

包涵體主要是由于在重組蛋白的表達(dá)過程中缺乏某些蛋白質(zhì)折疊的輔助因子，而無法形成正確的次級(jí)鍵等原因形成的［7］；也可能是外源基因合成速度太快，沒有足夠的時(shí)間進(jìn)行折疊，二硫鍵不能正確的配對(duì)，使過多的蛋白間發(fā)生非特異性結(jié)合，蛋白質(zhì)無法達(dá)到足夠的溶解度［8］。IFN－β的表達(dá)產(chǎn)物往往以包涵體形式存在，要通過變復(fù)性過程才可以獲得有活性的IFN－β。Li等［9］比較了7mol·L－1鹽酸 胍、8mol·L－1尿 素、2%Sarkosyl與2mol·L－1尿素加pH值的變性液對(duì)rhG－CSF包涵體蛋白的溶解和復(fù)性的影響，結(jié)果顯示：高pH值環(huán)境能有效溶解該蛋白，低濃度的尿素具有協(xié)同作用。Singh等［10］研究了含有不同羥基的醇類對(duì)hGH包涵體蛋白的溶解，結(jié)果表明：6mol·L－1正丙醇加2mol·L－1尿素的溶解效果最好。2011年Yang等［11］用這種兩步變性一步復(fù)性方法對(duì)91種包涵體從進(jìn)行變復(fù)性，其中76%的蛋白平均復(fù)性率高于75%。本文作者在實(shí)驗(yàn)中嘗試了更換溶解液、改變尿素濃度、改變?nèi)芙猸h(huán)境、調(diào)整溶解液pH值、調(diào)整誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)間等方法，但蛋白包涵體仍難以被溶解；在使用1g菌加20mL溶解液時(shí)發(fā)現(xiàn)包涵體有溶解，結(jié)果表明：增加溶解液比例可以提高包涵體的溶解率。

研究［12］顯示：低溫誘導(dǎo)表達(dá)可提高可溶性目的蛋白產(chǎn)量；Yang等［13］認(rèn)為：低溫能降低蛋白質(zhì)合成的速率，改變多肽折疊的動(dòng)力學(xué)，從而導(dǎo)致正確折疊的蛋白增加。也有研究［14－15］顯示：可能在較低溫度下，與蛋白折疊和蛋白聚合相關(guān)的蛋白的表達(dá)更有利于菌體形成穩(wěn)定的可溶性蛋白。

本研究中蛋白在低溫過夜誘導(dǎo)時(shí)未出現(xiàn)可溶性表達(dá)，這可能與蛋白本身特性有關(guān)。不同的菌株其最佳誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)間是不同的，即便是同一種菌株，在細(xì)菌生長密度和蛋白表達(dá)條件不一樣的時(shí)候其最佳表達(dá)時(shí)間也會(huì)有所差別。誘導(dǎo)時(shí)間過短，表達(dá)水平下降；誘導(dǎo)時(shí)間過長，由于培養(yǎng)基的消耗，使細(xì)菌老化，也會(huì)導(dǎo)致表達(dá)量的降低。采用不同濃度的IPTG、37℃誘導(dǎo)相同時(shí)間發(fā)現(xiàn)：IPTG濃度在0.1～1.0mmol·L－1之間表達(dá)量相同。

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