紫外分光光度法在沒食子酸體外還原Fe3＋能力檢測中的應(yīng)用及其意義

伍翔群，于 蘭，于 杰，黃彩婷，許維國，牛鳳蘭

（1.吉林大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院衛(wèi)生檢驗學(xué)教研室，吉林 長春 130021；2.長春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院腦病科，吉林 長春 130021；3.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院電診科，吉林 長春 130033）

沒食子酸（gallic acid，GA）是一種廣泛存在于水果和中草藥等植物中的天然酚酸類化合物，是沒食子、余甘子、藏青果、紅景天和訶子等中藥材的藥理活性組分，也是一些純中藥制劑的有效成分。研究［1－4］表明：GA具有較強(qiáng)的抗氧化性，具有抗菌、抗病毒和抗腫瘤作用。研究［5－7］證明：GA通過抗氧化作用抑制小鼠紅細(xì)胞溶血活性，抑制小鼠腦、腎勻漿脂質(zhì)過氧化作用，對大鼠的缺血－再灌注損傷起保護(hù)作用，對與1型糖尿病相關(guān)的心肌損傷的治療有效等。大多數(shù)人工合成抗氧化劑均具有一定的毒副作用，與此相比，GA作為天然的抗氧化劑安全無毒并具有良好的生理功效。因此，檢驗GA的抗氧化性可為其應(yīng)用提供實驗依據(jù)?？箟难幔淳S生素C（vitamin C，Vc），為水溶性維生素，具有極強(qiáng)的還原性，在食品加工業(yè)中被廣泛使用，故本研究采用Vc作為抗氧化對照藥。H2O2／Fe2＋體系可通過Fenton反應(yīng)使鄰二氮菲－Fe2＋被羥自由基氧化為鄰二氮菲－Fe3＋［8］，因此，應(yīng)用紫外分光光度計檢測Vc或GA還原Fe3＋的產(chǎn)物的吸光度（A）值，可間接檢測其抗氧化能力。在鐵氰化鉀－Fe3＋體系中以Fe3＋做氧化劑，定量氧化Vc或GA并生成Fe2＋，后者可在一定條件下與顯色劑生成藍(lán)色配合物 KFe3＋［Fe2＋（CN）6］。通過分光光度法測定該配合物的A值，建立間接測定受試物抗氧化能力的方法［9］。本研究采用上述2種體系測定GA的體外抗氧化能力，結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 鄰二氮菲（天津市北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠），配置成濃度為5mmol·L－1鄰二氮菲乙醇溶液；30%過氧化氫（北京化工廠），配置成1%過氧化氫溶液；鐵氰化鉀（天津市化學(xué)試劑一廠），配置成10g·L－1鐵氰化鉀溶液；自制0.01和0.10mol·L－1PBS緩沖溶液；鹽酸（北京化工廠）12mol·L－1，用去離子水稀釋10000倍后為1.2×10－3mol· L－1和稀釋100倍后 為0.12mol·L－1；GA（北京化工廠）、Vc（吉林顯峰科技制藥有限公司），各配置成濃度為1.6g·L－1溶液；硫酸亞鐵（北京化工廠），配置成濃度為7.5mmol·L－1硫酸亞鐵溶液；氯化鐵（北京化工廠），配置成1g·L－1氯化鐵溶液。所有試劑均為分析純，水為二次去離子水。PE Lambda 900紫外可見分光光度計（美國PE公司），水浴箱和電子天平（上海實驗儀器廠），超聲波振蕩器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 紫外分光光度法驗證GA和Vc體外抗氧化性的可行性 為了確定最佳測試條件，排除干擾因素，用紫外分光光度計對GA和Vc溶液進(jìn)行全波長掃描。

1.3 GA和Vc在鄰二氮菲－Fe2＋體系中還原Fe3＋能力的檢測 在1～9號容量瓶中均依次精密加入鄰二氮菲溶液1.5mL，0.01mol·L－1PBS緩沖溶液4mL，硫酸亞鐵溶液1mL，立即混勻備用。其中1～4號容量瓶為GA組，5～8號為Vc組，9號為control 1組。在GA組中按順序依次準(zhǔn)確加入GA溶液0.25、0.50、0.75和1.00mL，使1～4號瓶 GA濃度分別為0.04、0.08、0.12 和0.16g·L－1。在Vc組中按順序依次準(zhǔn)確加入Vc溶液0.25、0.50、0.75和1.00mL，使5～8號的Vc濃度分別為0.04、0.08、0.12和0.16g·L－1。隨后向1～9號容量瓶中加入過氧化氫溶液各1mL。所有容量瓶用去離子水定容至刻度，混勻，37℃水浴1h。利用紫外分光光度計，于波長為536nm處，用1cm比色皿，以試劑空白為對照，檢測其A值。重復(fù)3次取平均值。

1.4 乙醇對GA和Vc在鄰二氮菲－Fe2＋體系中還原Fe3＋能力影響的檢測 取2只潔凈容量瓶標(biāo)記為A和B，向其中各加入鄰二氮菲溶液1.5mL，0.01mol·L－1PBS緩沖溶液4mL，硫酸亞鐵溶液1mL，混勻備用。A容量瓶用乙醇定容至刻度，B容量瓶用去離子水定容至刻度，混勻，37℃水浴1h。利用紫外分光光度計，于波長為536nm處，用1cm比色皿檢測其A值。重復(fù)3次取平均值。

1.5 GA和Vc在鐵氰化鉀－Fe3＋體系中還原Fe3＋能力的檢測 在11～19號10mL容量瓶中均依次精密加入氯化鐵溶液0.5mL，鐵氰化鉀溶液2mL，0.01mol· L－1PBS 溶 液 2mL，1.2×10－3mol·L－1鹽酸溶液0.5mL，混勻備用。其中11～14號容量瓶為GA組，15～18號為Vc組，19號為control 2組。

在GA組中按順序依次準(zhǔn)確加入GA溶液0.25、0.50、0.75和1.00mL，使 GA 濃度分別為0.04、0.08、0.12和0.16g·L－1。在 Vc組中按順序依次準(zhǔn)確加入 Vc溶液0.25、0.50、0.75和1.00mL，使Vc濃度分別為0.04、0.08、0.12和0.16g·L－1。所有容量瓶用去離子水定容至刻度，混勻，室溫反應(yīng)30min。利用紫外分光光度計，于波長為700nm處，用1cm比色皿，以試劑空白為對照，檢測其A值。重復(fù)3次取平均值。

1.6 GA和Vc在不同H＋濃度的鐵氰化鉀－Fe3＋體系中還原Fe3＋能力的檢測 在41～48號、C號、D號10mL容量瓶中均依次加入0.1mol·L－1PBS溶液2mL，氯化鐵溶液0.5mL，鐵氰化鉀溶液2mL。在41～44號容量瓶中加入0.12mol·L－1鹽酸0.7mL，在45～48號容量瓶中加入0.12mol·L－1鹽酸0.8mL，混勻備用。41～44號容量瓶為GA組，45～48號為Vc組，49號為control 3組，50號為control 4組。

在GA組中按順序依次準(zhǔn)確加入GA溶液0.25、0.50、0.75和1.00mL，使其終濃度分別為0.04、0.08、0.12和0.16g·L－1。在 Vc組中按順序依次準(zhǔn)確加入 Vc溶液0.25、0.50、0.75和 1.00mL，使其終濃度分別為 0.04、0.08、0.12和 0.16g·L－1。在C號容量瓶中加入0.12mol·L－1鹽酸0.75mL，GA 0.50mL。在D號容量瓶中加入0.12mol·L－1鹽酸0.75mL，Vc 0.50mL。在49和50號10mL容量瓶中依次加入0.1mol·L－1PBS溶液2mL，氯化鐵溶液0.5mL，鐵氰化鉀溶液2mL。在49號容量瓶中加入0.12mol·L－1鹽酸0.7mL，在50號容量瓶中加入0.12mol·L－1鹽酸0.8mL。所有容量瓶用去離子水定容至刻度，混勻，室溫反應(yīng)30min。利用紫外分光光度計，于波長為700nm處，用1cm比色皿，以試劑空白為對照，檢測其A值。重復(fù)3次取平均值。

1.7 鹽酸對GA和Vc在鐵氰化鉀－Fe3＋體系中還原Fe3＋能力影響的檢測 在21～40號10mL容量瓶中均依次加入0.1mol·L－1PBS溶液2mL，氯化鐵溶液0.5mL，鐵氰化鉀溶液2mL。21～30號容量瓶為GA組，31～40號為Vc組。在GA組中按順序依次準(zhǔn)確加入0.12mol·L－1鹽酸0.10、0.20、0.30、0.40、0.50、0.60、0.70、0.80、0.90 和 1.00mL，使其終濃度分別為0.12×10－2、0.24×10－2、0.36×10－2、0.48×10－2、0.60×10－2、0.72×10－2、0.84×10－2、0.96×10－2、1.08×10－2和1.20×10－2mol·L－1；Vc組同GA組操作。在GA組容量瓶中均加入GA溶液0.5mL，Vc組容量瓶中均加入Vc溶液0.5mL。所有容量瓶用去離子水定容至刻度，混勻，室溫反應(yīng)30min。利用紫外分光光度計，于波長為700nm處，用1cm比色皿，檢測其A值。重復(fù)3次取平均值。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 17.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計分析，GA與VC組檢測指標(biāo)以表示，組間比較采用two－way ANOVA方差分析。

2 結(jié) 果

2.1 紫外分光光度法驗證GA和Vc體外抗氧化性的可行性 對GA和Vc溶液進(jìn)行全波長掃描測得最大吸收峰分別為267.05和260.95nm，而在實驗測試條件536及700nm處均無明顯吸收，不會對測定結(jié)果造成干擾。因此，用比色法測定GA和Vc體外抗氧化能力可行。

2.2 GA和Vc在鄰二氮菲－Fe2＋體系中還原Fe3＋的能力 采用SPSS分析得：GA和Vc溶液間A值的比較，均方 MS＝0.005，F(xiàn)＝56.315，P＜0.05，GA組和Vc組A值差異有統(tǒng)計學(xué)意義。GA組和Vc組不同濃度溶液A值的比較，均方MS＝0.030，F(xiàn)＝358.194，P＜0.05，GA 組和Vc組不同濃度溶液A值差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。在此體系中所有藥物濃度下，GA組的A值均大于Vc組。表明在此體系中GA的體外還原Fe3＋能力強(qiáng)于Vc。

2.3 乙醇作用下GA和Vc在鄰二氮菲－Fe2＋體系中還原Fe3＋的能力 用純乙醇定容的反應(yīng)液所測A值為1.5491，用去離子水定容的反應(yīng)液所測A值為1.7278。結(jié)果表明：乙醇對試劑的A值有影響。

2.4 GA和Vc在鐵氰化鉀－Fe3＋體系中還原Fe3＋的能力 采用SPSS分析得：GA和Vc溶液間A值的比較，均方 MS＝1.130，F(xiàn)＝15.568，P＜0.05，GA組和Vc組A值差異有統(tǒng)計學(xué)意義。GA組和Vc組不同濃度溶液A值的比較，均方MS＝0.897，F(xiàn)＝12.355，P＜0.05，GA 組和Vc組不同濃度溶液A值差異有統(tǒng)計學(xué)意義。見表2。

在0.04g·L－1濃度時，GA的A值大于Vc的A值，即GA的體外還原Fe3＋的能力強(qiáng)于Vc。其余濃度下GA的A值均小于Vc，即在此體系此濃度下GA的體外還原Fe3＋的能力弱于Vc。

2.5 GA和Vc在不同H＋濃度的鐵氰化鉀－Fe3＋體系中還原Fe3＋的能力 采用SPSS分析得：GA和Vc溶液間A值的比較，均方MS＝0.543，F(xiàn)＝6.871，P＜0.05，GA組和Vc組A值差異有統(tǒng)計學(xué)意義。GA組和Vc組不同濃度溶液A值比較，均方 MS＝0.539，F(xiàn)＝6.815，P＜0.05，GA組及和Vc組不同濃度溶液A值差異有統(tǒng)計學(xué)意義。見表3。在此體系中不同藥物濃度下，GA組的A值均大于Vc組。表明在此體系中GA的體外還原Fe3＋能力強(qiáng)于Vc。

表1 GA和Vc在Fenton羥自由基體系中的A值Tab.1 The A values of GA and Vc in the Fenton hydroxyl radicals system （n＝3，）

表1 GA和Vc在Fenton羥自由基體系中的A值Tab.1 The A values of GA and Vc in the Fenton hydroxyl radicals system （n＝3，）

The A value of control 1was 1.2355±0.0411.＊ P＜0.05compared with Vc group；△P＜0.05compared with 0.04g·L－1 group.

Group 0.04 0.08 0.12 0.16 GA 1.4485±0.1467＊ 1.5904±0.1533＊△ 1.6574±0.1350＊△ 1.8275±0.1451＊A value［ρB／（g·L－1）］△Vc 1.3650±0.1366 1.4754±0.1477△ 1.5414±0.0959△ 1.6570±0.1217△

表2 GA和Vc在鐵氰化鉀－Fe3＋體系中的A值Tab.2 The A values of GA and Vc in the potassium ferricyanide－Fe3＋system （n＝3，）

表2 GA和Vc在鐵氰化鉀－Fe3＋體系中的A值Tab.2 The A values of GA and Vc in the potassium ferricyanide－Fe3＋system （n＝3，）

The A value of control 2was 0.0669±0.0000.＊ P＜0.05compared with Vc group；△P＜0.05compared with 0.04g·L－1 group.

Group 0.04 0.08 0.12 0.16 GA 0.3055±0.0017＊△ 0.4966±0.0044＊△ 0.6734±0.0008＊△ 0.8864±0.0008＊A value［ρB／（g·L－1）］△Vc 0.0861±0.0008△ 1.1845±0.0056△ 1.5919±0.0010△ 1.6257±0.0006△

表3 GA和Vc在不同H＋濃度的鐵氰化鉀－Fe3＋體系中的A值Tab.3 The A values of GA and Vc in the potassium ferricyanide－Fe3＋system with different concentrations of H＋（n＝3，）

表3 GA和Vc在不同H＋濃度的鐵氰化鉀－Fe3＋體系中的A值Tab.3 The A values of GA and Vc in the potassium ferricyanide－Fe3＋system with different concentrations of H＋（n＝3，）

The A value of control 3was 0.0618±0.0001；the A value of control 4was 0.0606±0.0000；the A value of C was 1.5917±0.0026；the A value of D was 0.1334±0.0009.＊ P＜0.05compared with Vc group；△P＜0.05compared with 0.04g·L－1 group.

Group 0.04 0.08 0.12 0.16 GA 0.1381±0.0038＊ 0.2239±0.0041 0.8755±0.0023＊△ 1.7094±0.0014＊A value［ρB／（g·L－1）］△Vc 0.1009±0.0047 0.2802±0.0058 0.4521±0.0014△ 0.5473±0.0017△

2.6 不同濃度鹽酸作用下GA和Vc在鐵氰化鉀－Fe3＋體系中還原Fe3＋的能力 采用SPSS分析得：GA和Vc溶液間A值的比較，均方MS＝0.112，F(xiàn)＝1.920，P＞0.05，GA組和Vc組A值差異無統(tǒng)計學(xué)意義。GA組和Vc組不同鹽酸濃度溶液A值的比較，均方 MS＝1.022，F(xiàn)＝17.524，P＜0.05，GA組和Vc組不同鹽酸濃度溶液A值差異有統(tǒng)計學(xué)意義。見表4。在相同濃度的鹽酸溶液中GA和Vc的A值差別大。Vc組鹽酸濃度為0.84×10－2和0.96×10－2mol·L－1的溶液 A值呈跳躍性改變，躍至A值最大值。

3 討 論

氧化應(yīng)激是指機(jī)體活性氧物質(zhì)產(chǎn)生過多，機(jī)體抗氧化能力降低，氧化系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)平衡紊亂導(dǎo)致組織或細(xì)胞損傷的病理過程。在病理條件下或衰老時，細(xì)胞內(nèi)活性氧的增加超過抗氧化防御能力，就會引起脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和DNA的氧化損傷，可能導(dǎo)致動脈粥樣硬化、心力衰竭、高血壓等心血管疾病的發(fā)生［10］。研究［11］顯示：臨床上現(xiàn)有的具有抗氧化作用的藥物治療效果具有一定局限性，從中藥或者天然植物藥中篩選抗氧化活性成分，以此為基礎(chǔ)開發(fā)新藥是解決此問題的有效途徑之一。在體外模擬氧化體系下GA的抗氧化作用研究成為關(guān)注的焦點。在鄰二氮菲－Fe2＋體系中，加入硫酸亞鐵溶液后必須立即混勻，否則會使局部顏色過濃影響實驗結(jié)果的重復(fù)性。較多的乙醇對實驗結(jié)果有影響，故在鄰二氮菲－Fe2＋體系中測定物質(zhì)抗氧化性時應(yīng)考慮乙醇的還原性，對乙醇的影響進(jìn)行校正或更換溶劑。在鐵氰化鉀－Fe3＋體系中，低濃度GA在H＋濃度較小的環(huán)境下體外還原Fe3＋能力較強(qiáng)，高濃度GA在H＋濃度較大的環(huán)境下體外還原Fe3＋能力較強(qiáng)。Vc則在H＋濃度較小的環(huán)境下體外還原Fe3＋能力較強(qiáng)。因此，在GA的應(yīng)用中應(yīng)考慮劑量與體系H＋濃度對其抗氧化性的影響。

表4 不同濃度鹽酸作用下GA和Vc在鐵氰化鉀－Fe3＋體系中的A值Tab.4 The A values of GA and Vc in the potassium ferricyanide－Fe3＋ system after treated with different concentrations of HCl （n＝3，）

表4 不同濃度鹽酸作用下GA和Vc在鐵氰化鉀－Fe3＋體系中的A值Tab.4 The A values of GA and Vc in the potassium ferricyanide－Fe3＋ system after treated with different concentrations of HCl （n＝3，）

＊ P＜0.05compared with 0.12×10－2 mol·L－1 group.

Group 0.24 0.36 0.48 0.60 GA 0.2085±0.0043 0.2676±0.0011 0.2236±0.00 A value（×10－2 mol·L－1）0.1258 0.2127±0.0037 0.2067±0.0033 Vc 0.0609±0.0021 0.0625±0.0031 0.0624±0.0022 0.0716±0.0060 0.0772±0.0018 Group 0.84 0.96 1.08 1.20 GA 0.1986±0.0009 1.2607±0.0056＊ 1.5134±0.0019＊ 1.6326±0.0003＊ 1.6165±0.0008 A value（×10－2 mol·L－1）0.72＊Vc 0.0842±0.0035 0.2310±0.0025＊ 1.7380±0.0034＊ 1.7040±0.0006＊ 1.7525±0.0012＊

本實驗結(jié)果顯示：Vc組鹽酸濃度為0.84×10－2和0.96×10－2mol·L－1的溶液 A值呈跳躍性改變，躍至 A值最大值。鹽酸濃度為0.84×10－2mol·L－1時為GA反應(yīng)的適宜酸度，此條件下Vc組溶液的A值過小，不利于低劑量Vc反應(yīng)液的A值檢測。C號溶液即GA的A值為1.5917，接近實驗可得最大A值，而D號溶液即Vc的A值為0.1334，接近實驗可得最小吸光度?？梢姡珿A和Vc的最佳反應(yīng)體系的條件并不一致，可能是兩者本身化學(xué)結(jié)構(gòu)差異所致。研究［12］表明：沒食子酸在堿性、中性、強(qiáng)氧化條件下不穩(wěn)定，在酸性環(huán)境、強(qiáng)光、高溫條件下穩(wěn)定，而不同的抗氧劑對其均有保護(hù)作用。且鹽酸濃度對實驗結(jié)果影響很大，試劑加入順序也對實驗結(jié)果有一定的影響。研究［13］表明：Fe3＋在不同pH值條件下的化學(xué)形態(tài)不同，催化活性差異較大，影響化學(xué)發(fā)光特性。因此在實驗過程中應(yīng)控制鹽酸濃度。

本實驗結(jié)果表明：GA在體外一定條件下的抗氧化能力強(qiáng)于Vc，而Vc是公認(rèn)的抗氧化劑，說明GA在抗氧化方面具有良好的應(yīng)用前景。

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