雙抗體間接夾心ELISA法檢測血清MUC1蛋白方法的建立及其在肺癌診斷中的應用

何秋立，張 旭，王 娟，翟瑞萍，喬彩霞，孫霞霞，倪維華，高素君，臺桂香

（1.吉林大學第一醫(yī)院腫瘤中心，吉林 長春 130021；2.吉林大學白求恩醫(yī)學院免疫學教研室，吉林 長春 130021）

肺癌是當前世界各地發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤之一，早期診斷對其預后有重要意義［1］。但是肺癌的早期診斷仍是臨床工作者面臨的難題，血清腫瘤標志物的檢測為解決該難題提供了新的研究方向［2］。黏蛋白1（mucin 1，MUC1）是黏蛋白家族的重要成員，屬于跨膜糖蛋白。在腫瘤細胞中，細胞骨架破壞，導致其胞外段脫落形成血清MUC1。在乳腺癌、卵巢癌和肺癌等多種實體腫瘤及部分血液系統惡性腫瘤中，均存在MUC1的高表達，MUC1是一種非常有價值的腫瘤標志物［3－4］，其中血清 MUC1作為檢測乳腺癌的腫瘤標志物，對疾病診斷及預后有重要意義，已得到大量臨床資料［5－6］的證實。臨床上廣泛應用 CA15－3試劑盒檢測血清MUC1表達水平，該試劑盒以單克隆抗體為包被抗體和檢測抗體，只針對某一免疫表位，針對肺癌的檢出率低［7－9］，在實驗室前期制備兔抗人MUC1多克隆抗體的基礎上［10］，本文作者首次嘗試改善檢測抗體為多克隆抗體，建立一種新的檢測血清 MUC1的酶聯免疫吸附法（enzymelinked immunesorbent assay，ELISA）試劑盒，對48例肺癌患者的血清MUC1進行檢測，并與臨床上常用的CA15－3試劑盒進行比較，評估其在肺癌診斷中的應用價值。

1 資料與方法

1.1 研究對象 肺癌組為48例肺癌患者，均為2011年2—5月于吉林大學第一醫(yī)院胸外科和腫瘤科的住院患者，經術后病理確診。肺癌組患者年齡35～73歲，平均年齡59歲；其中男性28例，女性20例；腺癌26例，鱗癌15例，小細胞肺癌7例。肺良性疾病組為7例同期本院呼吸科住院患者，診斷為肺炎或肺結核；其中男性4例，女性3例，平均年齡60歲。健康對照組選取20例同期在本院體檢中心體檢合格的正常人群；其中男性12例，女性8例，平均年齡58歲。各組患者均經吉林大學第一醫(yī)院倫理委員會允許并與實驗參與者簽署知情同意書。

1.2 主要試劑和儀器 鼠抗人MUC1單克隆抗體GP1.4（美國Neo marker公司），MUC1標準品及兔抗人MUC1多克隆抗體（吉林大學白求恩醫(yī)學院免疫學教研室提供），山羊抗兔IgG－HRP（美國Sigma公司）；CA15－3試劑盒（Roche公司），全自動電化學發(fā)光免疫分析儀（羅氏診斷公司）。

1.3 血清采集 收集研究對象的空腹靜脈血，肝素抗凝，室溫放置30min，4℃放置過夜，次日3000r·min－1離心20min。收集血清，放置－20℃保存。檢測前先放置4℃融化，然后置室溫平衡后使用。

1.4 雙抗體間接夾心ELISA方法的建立 應用棋盤滴定法選擇包被抗體、檢測抗體、酶標抗體的最佳工作濃度。以鼠抗人MUC1單克隆抗體為包被抗體，采用5個質量濃度（0.02、0.10、0.20、0.40和1.00mg·L－1）包被酶標板，2%BSA 封閉；加入倍比稀釋的 MUC1蛋白標準品（0.5、1.0、 2.0、 4.0、 8.0、 16.0、 32.0 和64.0μg·L－1）；再以兔抗人MUC1多克隆抗體作為檢測抗體，抗體設5個稀釋濃度（20.0、15.0、10.0、5.0和2.5mg·L－1）；然后加入山羊抗兔HRP酶標抗體，采用5個稀釋濃度（1∶2500、1∶5000、1∶10000、1∶20000和1∶40000）；加入底物OPD溶液顯色；2mol·L－1的H2SO4終止反應，經酶標儀檢測在490nm波長處的吸光度（A）值。根據檢測結果確立雙抗體夾心ELISA方法的最佳實驗條件、敏感度及標準曲線。通過繪制受試者工作特征曲線（receive operating characteristic curve，ROC）確定最佳cut－off值。ROC是反映敏感度和特異度連續(xù)變量的綜合指標，通過構圖法揭示敏感度和特異度的相互關系，其通過將連續(xù)變量設定出多個不同的臨界值，從而計算出一系列敏感度和特異度，再以敏感度為縱坐標、假陽性率（1－特異度）為橫坐標繪制出曲線，曲線下面積（area under curve，AUC），記為Az。Az＝0.5表示完全無價值的診斷，Az＝0.5～0.7表示診斷準確性較低，Az＝0.7～0.9表示診斷準確性中等，Az＝0.9～1.0表示診斷準確性較高，Az＝1表示完全理想的診斷。cut－off值取自ROC上敏感度和特異度最佳平衡位點所對應的數值，從而使實驗的敏感度和特異度均達到較高的水平，使誤診率和漏診率均處于較低水平。特異度＝真陰性／（假陽性＋真陰性），敏感度＝真陽性／（真陽性＋假陰性）。約登指數＝敏感度＋特異度－1，其表示篩選方法發(fā)現真正的患者與非患者的能力，指數越大說明效果越好，真實性越大。

1.5 血清MUC1的測定 應用本研究建立的雙抗體間接夾心ELISA方法，按上述步驟，采用設置好的最佳實驗條件檢測肺癌組、肺良性疾病組和健康對照組研究對象外周血清MUC1表達水平。同時，嚴格按照CA15－3試劑盒的說明書操作，應用羅氏全自動電化學發(fā)光免疫分析儀檢測各組研究對象血清MUC1表達水平。

1.6 統計學分析 采用SPSS 17.0軟件包進行統計學處理，各組血清MUC1蛋白表達水平為非正態(tài)分布數據，表示為中位數（P25，P75），總體比較采用非參數Kruskal－Wallis檢驗，兩兩比較采用Mann Whitney檢驗。

2 結 果

2.1 雙抗體間接夾心ELISA方法中各組分最佳反應濃度及敏感度 通過棋盤滴定法對包被抗體、檢測抗體和酶標抗體進行不同的組合篩選，最后確定試劑盒各個組分最佳工作濃度為：包被抗體（GP1.4抗體）每孔 0.1μg；檢測抗體（兔抗人MUC1多克隆抗體）的工作濃度為15mg·L－1；酶標抗體IgG－HRP最佳稀釋比例為1∶5000。MUC1標準品稀釋為8個濃度：0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、16.0、32.0和64.0μg·L－1。采用上述條件，采用本研究建立的雙抗體間接夾心ELISA方法對不同濃度的MUC1蛋白標準品進行檢測，繪制出標準曲線，敏感度最高為0.5μg·L－1。見圖1。

2.2 血清MUC1蛋白表達水平檢測結果 應用建立的MUC1雙抗體間接夾心ELISA法，對48例肺癌患者、7例肺良性疾病患者和20例健康體檢者外周血清中MUC1蛋白表達水平進行檢測。肺癌組血清 MUC1蛋白平均濃度為2.70（1.64，4.07）μg·L－1，肺良性疾病組血清MUC1蛋白平均濃度為1.21（0.94，1.33）μg·L－1，健康對照組血清 MUC1蛋白平均濃度為1.44（1.22，1.66）μg·L－1。肺癌患者血清MUC1蛋白表達水平明顯高于肺良性疾病組與健康對照組（P＜0.01）；肺良性疾病組與健康對照組比較差異無統計學意義（P＞0.05）。應用CA15－3試劑盒檢測血清MUC1蛋白水平：肺癌組患者血清MUC1蛋白平均濃度高于肺良性疾病組和健康對照組，差異有統計學意義（P＜0.01）。見表1。

圖1 雙抗體間接夾心ELISA法的標準曲線Fig.1 Standard curve of double－antibody indirect sandwich ELISA

表1 間接夾心ELISA法與CA15－3試劑盒檢測各組血清MUC1蛋白表達水平Tab.1 The serum MUC1protein expression levels in various groups detected by indirect sandwich ELISA and CA15－3kit ［M（P25，P75）］

2.3 雙抗體間接夾心ELISA法確定血清 MUC1正常值 應用本研究建立的ELISA試劑盒檢測肺癌組和非肺癌組患者的血清MUC1蛋白表達水平后，并應用SPSS 17.0進行統計學分析，分別計算出所有截斷點的敏感度和假陽性率（1－特異度），確定cut－off值，得出肺癌患者與非肺癌組最佳cut－off值為1.98μg·L－1，Az＝0.87。

2.4 雙抗體間接夾心ELISA法與CA15－3試劑盒檢測結果比較 根據雙抗體間接夾心ELISA法的檢測結果和通過ROC曲線確定的cut－off值，再進行進一步分析。48例肺癌患者中有30例血清MUC1蛋白表達水平大于1.98μg·L－1，為陽性；20例健康對照及7例肺良性疾病患者均為陰性。應用羅氏全自動電化學發(fā)光免疫分析儀檢測血清MUC1表達水平，根據CA15－3試劑盒說明書提供的cut－off值（25U·mL－1），48例肺癌患者中9例為陽性；20例健康對照及7例肺良性疾病患者均為陰性。本研究建立的ELISA試劑盒檢測肺癌血清 MUC1的敏感度為62.5%（30／48），特異度為100%（27／27），約登指數為0.6250；CA15－3試劑盒檢測肺癌的敏感度為18.75%（9／48），特異度為100%（27／27），約登指數為0.1875。

圖2 雙抗體間接夾心ELISA法檢測肺癌組與非肺癌組血清MUC1蛋白表達水平的ROCFig.2 The ROC of MUC1protein expression levels in lung cancer group and non－lung cancer group detected by doubleantibody indirect sandwich ELISA method

3 討 論

針對臨床上CA15－3試劑盒敏感度低的局限性，本文作者通過改善檢測抗體為多克隆抗體，成功建立了一種新的雙抗體間接夾心ELISA試劑盒，并對本院的肺癌患者、肺良性疾病患者及健康對照者血清MUC1蛋白水平進行檢測，通過ROC確定最佳cut－off值，并將檢測結果與CA15－3試劑盒比較，本研究建立的試劑盒在保持特異度的同時，明顯提高了檢測肺癌的敏感度及真實性。多項臨床研究［7－9］用已經商業(yè)化的ELISA方法、化學發(fā)光免疫法和電化學發(fā)光等不同方法檢測肺癌患者血清MUC1表達水平，其敏感度均在20%左右，均低于本研究建立的雙抗體間接夾心ELISA法。有研究［11］應用放射免疫法檢測血清 CA15－3（MUC1）水平，其診斷肺癌的敏感度和特異度分別為62.68%和88.00%。但是ELISA仍存在高特異度、操作簡單和方便等優(yōu)勢。

本研究建立的雙抗體間接夾心ELISA方法在保持特異度的同時，也提高了敏感度，原因可能如下：目前，商業(yè)化試劑盒均選用單克隆抗體作為包被抗體和檢測抗體，由于不同腫瘤在不同個體中所暴露的MUC1抗原表位不同，單克隆抗體的應用雖大大提高了識別抗原的特異度，但由于單克隆抗體的結合表位單一，因此可能漏診許多陽性病例。本文作者根據夾心ELISA的原理，將針對MUC1的一種單克隆抗體包被，加入待檢樣本，待測抗原與固相載體表面的抗體形成抗原抗體復合物，再次加入針對MUC1蛋白的一種多克隆抗體形成雙抗體夾心免疫復合物；然后加酶標抗體。由于檢測抗體（二級抗體）為多克隆抗體，可與抗原多個表位結合，降低了漏檢率，在此基礎上又比商業(yè)化雙抗體夾心ELISA多加了一層抗體，放大倍數再次增高，因此大大提高了敏感度。而由于包被抗體仍是單克隆抗體，從而保證了該實驗的特異度。

在建立合理檢測方案的同時把腫瘤標志物檢測作為一項常規(guī)的針對于高危人群的腫瘤篩查方法是一種趨勢［12］，只有這樣才能真正實現肺癌的早期發(fā)現、早期治療，有效提高患者的生存率。本研究建立的ELISA試劑盒與臨床上常用的CA15－3試劑盒比較，檢測肺癌的敏感度及真實性得到明顯提高，且特異度高，穩(wěn)定性好，操作簡單、快速，普及比較方便，有望用于惡性腫瘤的早期診斷和風險人群的腫瘤篩選檢查等。如果將其進一步優(yōu)化，包被抗體和檢測抗體均采用多克隆抗體，并聯合檢測其他腫瘤標志物，肺癌檢測的敏感度可能會得到進一步提高。但是為了更好地驗證該方法的可行性和優(yōu)越性，還需要擴大研究樣本量，需要更多臨床資料的積累和大規(guī)模前瞻性研究。

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