無需逆轉(zhuǎn)錄的高通量多重呼吸道病毒RNA檢測技術(shù)的建立

楊丹麗，田曉怡，石偉先，鄭 直

1中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所生物化學(xué)與分子生物學(xué)系，北京 100005

2北京市疾病預(yù)防控制中心傳染病地方病控制所，北京 100013

呼吸道病毒是最常見的呼吸道病原體之一，能引起人群嚴(yán)重的呼吸道感染，具有較高的發(fā)病率和死亡率。據(jù)報(bào)道A和B型流感病毒、呼吸道合胞病毒、1、2和3型副流感病毒是嬰幼兒呼吸道感染的最主要誘因［1］。近幾年報(bào)道的冠狀病毒、鼻病毒、偏肺病毒等也是引起人類呼吸道感染的重要病毒［2-4］。呼吸道病毒暴發(fā)性強(qiáng)，如SARS、禽流感等病毒的暴發(fā)，給人類社會和國民經(jīng)濟(jì)帶來很大負(fù)擔(dān)［5］。由于臨床上待檢測樣品數(shù)量多，且待測呼吸道病毒種類繁多，變異性強(qiáng)，這給臨床診斷、治療及疾病監(jiān)控帶來很大困難?，F(xiàn)有方法如直接熒光抗體、細(xì)胞培養(yǎng)及各種PCR方法等檢測方法在靈敏度、特異性及樣品通量方面存在較大局限性，這使得對呼吸道病毒難以實(shí)現(xiàn)大規(guī)模、高通量的檢測篩查和監(jiān)測。本研究直接以病毒RNA為檢測靶標(biāo)，無需逆轉(zhuǎn)錄、靶標(biāo)擴(kuò)增等樣品前處理過程，利用以微球?yàn)榛A(chǔ)的高通量平臺，采取本課題組以往成功開發(fā)并應(yīng)用的RNA夾層雜交反應(yīng)捕獲靶標(biāo)RNA［6-7］，然后通過分支DNA技術(shù)［8］放大信號，對待測樣本中存在的呼吸道病毒進(jìn)行定性定量分析。

材料和方法

病毒總RNA 選用北京市疾病預(yù)防控制中心凍存的、經(jīng)實(shí)驗(yàn)室PCR確診感染8種病毒之一、且病毒含量較高的咽拭子樣本200 μl，使用QIAamp Viral RNA Mini Kit(QIAGEN公司)提取病毒總RNA。

靶標(biāo)病毒體外轉(zhuǎn)錄RNA 以各病毒的外轉(zhuǎn)錄RNA(in vitro-transcribed RNA，IVT-RNA)作為檢測靶標(biāo)。從NCBI下載病毒的靶標(biāo)核酸序列 (毒株序列號見表1)，并查到各病毒的屬內(nèi)保守區(qū)。利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)位于保守區(qū)內(nèi)的病毒特異性逆轉(zhuǎn)錄引物和PCR擴(kuò)增引物 (所有引物由Invitrogen公司合成，用PAGE法純化)，對病毒總RNA進(jìn)行特異逆轉(zhuǎn)錄及cDNA的特異擴(kuò)增。按照標(biāo)準(zhǔn)克隆流程獲得含目的片段的質(zhì)粒并測序正確后，對質(zhì)粒進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄和純化 (Life Technology MEGAscript轉(zhuǎn)錄試劑盒)，獲得體外轉(zhuǎn)錄靶標(biāo)RNA即IVT-RNA。

病毒RNA檢測技術(shù)、病毒靶標(biāo)及探針設(shè)計(jì) 利用本課題組以往研究的RNA夾層雜交結(jié)合信號放大技術(shù)和Luminex微球技術(shù)［6-7］建立一個(gè)多重檢測8種病毒RNA的方法。該方法通過在不同顏色的Luminex微球表面上進(jìn)行一系列的核酸片段雜交來完成檢測。檢測用寡核苷酸探針包含有與靶標(biāo)RNA特異性配對的序列，以及額外的3’端“尾巴”序列用于和微球表面或信號檢測系統(tǒng)特異性連接。這些探針分別稱作捕獲探針 (capture extender，CE)和檢測探針 (label extender，LE)［6-7］。CE探針的一部分與偶聯(lián)于微球表面的捕捉序列結(jié)合，另一部分與靶標(biāo)序列結(jié)合，雜交之后，就可以將靶標(biāo)序列固定下來。信號的放大是通過DNA信號放大分子介導(dǎo)的雜交進(jìn)行的:LE探針的一部分與靶標(biāo)序列結(jié)合，其尾部與DNA信號放大分子結(jié)合，最終通過熒光檢測DNA信號放大分子的存在及數(shù)量。

本研究作為對方法學(xué)的可行性研究和初步表征，采用體外合成的靶標(biāo)病毒RNA(IVT-RNA)為檢測對象，將其加入咽拭子采集液的裂解液中，以模擬病毒直接裂解所釋放的RNA。對于A和B型流感病毒、B型呼吸道合胞病毒、1和2型副流感病毒等5種待測病毒，選取了GenBank中該病毒某一特定毒株，以基因組中針對該病毒特異的病毒基因片段序列作為靶標(biāo)，選擇不同毒株間變異程度較低的保守區(qū)域設(shè)計(jì)檢測探針 (表1)以便檢測不同毒株。由于用于合成IVT-RNA的質(zhì)粒由臨床樣品克隆所得，其序列和設(shè)計(jì)探針時(shí)采用的GenBank序列并不完全相同，因此探針序列和待測靶標(biāo)IVT-RNA序列不完全互補(bǔ) (表1)。對于A型呼吸道合胞病毒，3型副流感病毒和偏肺病毒，探針則根據(jù)IVT-RNA設(shè)計(jì)，序列完全互補(bǔ)。

本技術(shù)工作流程類似于ELISA，可以在不進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和靶標(biāo)擴(kuò)增的情況下，同時(shí)進(jìn)行8種RNA檢測?？梢淮螌?shí)驗(yàn)并行檢測96個(gè)樣品。

病毒RNA檢測方法 針對每一種病毒靶標(biāo)RNA，本研究按已發(fā)表的設(shè)計(jì)原理［9］，經(jīng)過實(shí)驗(yàn)優(yōu)化，設(shè)計(jì)了一套能與Luminex檢測系統(tǒng)兼容的寡核苷酸探針。表1列出了每種病毒的探針數(shù)目。探針以外所需檢測試劑由Quantigene Plex 2.0 Assay試劑盒提供 (Panomics公司)。將1 μl包含8種病毒的IVTRNA混合物與32.4 μl咽拭子采集液、66.6 μl裂解液、8 μl 8種病毒探針混合物、以及2 μl磁性微球混合物 (包含8種已包被不同捕獲探針的磁性微球)混合后轉(zhuǎn)移至1個(gè)96孔板的孔中，密封后置于54℃空氣浴搖床 (Vortemp 56型，Labnet公司)孵育40 h，然后將96孔板置于磁鐵上，磁性微球吸附在孔底部后，將溶液 (包含未雜交的探針等)棄去，加入洗滌液對微球進(jìn)行洗滌后，根據(jù)試劑盒說明書要求對微球上的靶標(biāo)分子按步驟進(jìn)行熒光信號放大，最終通過Bio-Plex 200熒光微球檢測儀 (BioRad公司)分析微球的熒光信號［6-7］。

特異性檢測 為了檢查是否針對某種病毒的探針會和其他病毒非特異性結(jié)合產(chǎn)生交叉反應(yīng)信號，在反應(yīng)體系中加入針對8種病毒的微球及探針混合物，但只加一種病毒的IVT-RNA(0.5 amol/μl，相當(dāng)于3.01×105個(gè)拷貝)，檢測每種微球上的信號值。通過比較非靶標(biāo)病毒微球熒光信號值與背景熒光信號值，評估檢測系統(tǒng)的特異性。采用t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

靈敏度檢測 IVT-RNA經(jīng)過A260濃度定量 (Nanodrop 2000)后，用0.1 g/L酵母tRNA(Life Technology)對其進(jìn)行4倍系列濃度稀釋，最終獲得8至0.002 amol/L的7個(gè)濃度的一系列IVT-RNA。通過檢測該系列已知濃度樣品的信號值，建立IVT-RNA的標(biāo)準(zhǔn)曲線。檢測靈敏度即檢測下限設(shè)定為:標(biāo)準(zhǔn)曲線的低端開始偏離線性時(shí)的拷貝數(shù)值。

結(jié) 果

檢測特異性 在只有一種病毒RNA存在時(shí)，僅靶標(biāo)病毒微球產(chǎn)生特異性熒光信號。對于其他病毒微球，在高達(dá)3.01×105個(gè) (0.5 amol/μl)非特異性RNA分子存在情況下，產(chǎn)生的非特異信號與空白對照的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P均＞0.2，圖1)。

檢測靈敏度和線性范圍 標(biāo)準(zhǔn)曲線顯示:此檢測方法對8種病毒IVT-RNA的檢測靈敏度在0.002～0.0078 amol之間，也即1204～4695個(gè)拷貝的RNA分子，具有較高的靈敏度。本方法的線性范圍在0.008～2 amol(圖2)。

表1 靶標(biāo)呼吸道病毒的信息Table 1 Information of the respiratory virus targets and probes

圖1 高通量核酸檢測系統(tǒng)的特異性評估Fig 1 Specificity of the high-throughput respiratory virus detection method

圖2 梯度稀釋的IVT-RNA評估高通量檢測方法的靈敏度Fig 2 Sensitivity assessment using serially diluted IVT-RNAs for all 8 viruses

討 論

急性呼吸道感染絕大多數(shù)由病毒引起。由于這些病毒感染導(dǎo)致的臨床表現(xiàn)很相似，很難根據(jù)臨床癥狀準(zhǔn)確判斷致病原。據(jù)報(bào)道，在住院兒童中，仍然有20% ～30%的病原體還無法明確診斷［10］。在不同季節(jié)、不同年齡段流行的主要病毒也不同［11］。為了確切診斷出致病原，臨床病毒學(xué)實(shí)驗(yàn)室通常使用病毒培養(yǎng)及血清學(xué)方法來檢測常見呼吸道病毒。病毒的細(xì)胞培養(yǎng)是診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，但是細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間長，勞動強(qiáng)度大，不利于病毒的快速診斷;血清學(xué)方法快速，在較短的時(shí)間內(nèi)就可以獲得檢測結(jié)果［12］，但是它往往需要病毒感染人體一段時(shí)間后才能檢測，并且需要已知的特定抗原或抗體，目前現(xiàn)有抗原抗體通常不能滿足診斷要求［13］。

近些年來，分子診斷技術(shù)被陸續(xù)用于呼吸道病毒 檢 測，如 RT-PCR［14］、real-time PCR［15］等。這 些診斷技術(shù)不僅靈敏度高，特異性也相當(dāng)好。傳統(tǒng)的RT-PCR方法一次只能從一個(gè)標(biāo)本中檢出一種病毒。最近王春等［12］用多重RT-PCR方法彌補(bǔ)了這一缺陷，但PCR后續(xù)檢測流程依靠電泳，應(yīng)用于大樣本量的研究有很大的局限性。Mahoney等［16］用多重PCR擴(kuò)增不同類型的病毒分子，結(jié)合xMAP多重分析平臺檢測信號，簡化了后續(xù)檢測過程，得到了較高的檢測靈敏度和檢測通量。但是以上的多重PCR檢測技術(shù)都需要前期樣品處理，包括對核酸進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，標(biāo)記或擴(kuò)增等，重復(fù)性差。有證據(jù)表明:由不同實(shí)驗(yàn)室使用RT-PCR這一技術(shù)檢測同一樣品，往往會得出差異較大的結(jié)果［17］;其次，對樣品復(fù)雜的前處理過程極大地限制了此類檢測方法的通量，使得在大規(guī)模監(jiān)測時(shí)難以應(yīng)用。另外，由于呼吸道病毒的變異性較高，引物結(jié)合處的序列變異將造成PCR反應(yīng)失敗形成假陰性結(jié)果。最后，PCR反應(yīng)的污染問題也是一大難題，很容易出現(xiàn)微量污染造成的假陽性結(jié)果，這就限制了多重PCR類方法在普通臨床實(shí)驗(yàn)室的應(yīng)用［18］?？傊壳昂粑啦《緳z測方法無法同時(shí)滿足臨床上對靈敏度、特異性和高通量的要求。

本研究直接以病毒RNA作為檢測靶標(biāo)，無需逆轉(zhuǎn)錄、靶標(biāo)擴(kuò)增等常規(guī)樣品前處理步驟，不僅簡化了操作步驟，還避免了樣品處理過程中可能存在的差異，使得誤差顯著降低 (平均變異系數(shù)約5%)。本方法一次實(shí)驗(yàn)可同時(shí)檢測96個(gè)樣品，對每一個(gè)樣品可同時(shí)進(jìn)行8種常見病毒的檢測，所需樣本量很少。本研究數(shù)據(jù)表明該方法具有很好的特異性和較高的靈敏度，顯示此方法用于檢測常見呼吸道病毒有較高的的可行性。盡管從樣品裂解到得出結(jié)果需要3 d的時(shí)間，但人工操作時(shí)間僅2～3 h。對于需要連續(xù)檢測大批量樣品的檢測篩查，本方法能夠克服目前檢測方法在通量上的局限性，節(jié)約檢測成本，提高檢測通量。另外，此檢測系統(tǒng)針對每一靶標(biāo)RNA都至少有20條寡核苷酸探針，即使病毒在保守區(qū)存在約5%的變異，本方法仍可以獲得很好的結(jié)果。最后，與PCR直接放大檢測靶標(biāo)不同，本方法采用放大檢測信號的策略，可以避免由于產(chǎn)物交叉污染造成的假陽性結(jié)果。

綜上，本方法用于高通量多種呼吸道病毒檢測，同現(xiàn)有方法相比具有較明顯的優(yōu)勢，特別適用于流行病學(xué)監(jiān)測監(jiān)控及傳染病大規(guī)模篩查。該課題組下一步將進(jìn)行高通量流行病臨床標(biāo)本的檢測，以評估該方法在傳染病監(jiān)測預(yù)防中的作用。

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