鐵過(guò)載催化的氧化應(yīng)激對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的影響及其作用機(jī)制

盧文藝，趙明峰，Sajin Rajbhandary，趙 楠，謝 芳，肖 霞，穆 娟，李玉明

天津醫(yī)科大學(xué)一中心臨床學(xué)院 天津市第一中心醫(yī)院血液科，天津 300192

鐵過(guò)載是指由于大量鐵在體內(nèi)過(guò)度沉積而導(dǎo)致心、肝、胰等重要臟器結(jié)構(gòu)受損、功能障礙［1］。大量臨床資料已經(jīng)證明鐵過(guò)載可損傷骨髓的造血功能，近期又有研究報(bào)道這可能是由于鐵誘導(dǎo)的大量活性氧 (reactive oxygen species，ROS)影響造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞的功能［2-7］。目前尚不清楚鐵過(guò)載對(duì)骨髓微環(huán)境有無(wú)影響。作為骨髓微環(huán)境的重要成分，間充質(zhì)干細(xì)胞 (mesenchymal stem cells，MSCs)可通過(guò)分泌多種細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子，形成非造血基質(zhì)組織來(lái)支持骨髓造血，鐵過(guò)載有可能通過(guò)影響MSCs來(lái)?yè)p傷骨髓的造血功能。本研究觀(guān)察了鐵過(guò)載后MSCs增殖及凋亡的變化，并探索其相關(guān)機(jī)制，試圖找到治療鐵過(guò)載疾病的新的突破點(diǎn)。

材料和方法

主要試劑、設(shè)備和骨髓標(biāo)本 低糖DMEM培養(yǎng)基(L-DMEM)、胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)、0.25%胰酶均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，F(xiàn)ACSCalibur流式細(xì)胞儀及鼠抗人單克隆抗體CD34、CD45、CD90抗體均為美國(guó)BD公司產(chǎn)品，枸櫞酸鐵銨 (ferric ammonium citrae，F(xiàn)AC)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，ROS檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)公司，AnnexinV-FITC流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海美季公司，蛋白激酶B(protein kinase B，AKT)、磷酸化p38絲裂原活化蛋白激酶(phosphorylated p38 mitogen activated protein kinase，P-p38MAPK)、p38MAPK兔單抗均購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司，p53兔多抗購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz Technology公司，α-微管蛋白兔單抗購(gòu)自美國(guó)Epitomics公司，辣根過(guò)氧化物酶 (horse radish peroxidase，HRP)標(biāo)記的鼠抗兔抗體購(gòu)自Jackson ImmunoResearch Laboratories公司，多功能酶標(biāo)儀為美國(guó) BioTek公司產(chǎn)品，TH4-200型熒光倒置顯微鏡為日本Olympus公司產(chǎn)品。

骨髓標(biāo)本取自天津市第一中心醫(yī)院胸外科非血液病患者手術(shù)切除的未受累肋骨，肝素抗凝。

MSCs的培養(yǎng)及鑒定 取新鮮骨髓液4 ml，用淋巴細(xì)胞分離液分離提取單核細(xì)胞層，磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)洗滌2次。用完全培養(yǎng)液 (含15%FBS、100 U/ml青霉素、100 U/ml鏈霉素的L-DMEM培養(yǎng)液)調(diào)整細(xì)胞密度至1×106/ml，接種于25 cm2的培養(yǎng)瓶中，于37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。4～5 d后已有少量細(xì)胞貼壁呈梭形，首次全量換液，去除未貼壁細(xì)胞，以后每3 d換液一次。培養(yǎng)14 d后，細(xì)胞融合率達(dá)到80%～90%，用含0.1%乙二胺四乙酸 (ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA)的胰酶消化細(xì)胞，并按1∶2進(jìn)行傳代，取3～5代的MSCs進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。MSCs的純度通過(guò)流式細(xì)胞儀免疫標(biāo)記法 (CD34、CD45、CD90)鑒定。

鐵過(guò)載模型的建立及鑒定 用PBS溶解的FAC提供Fe3+離子，向?qū)嶒?yàn)組細(xì)胞的培養(yǎng)液內(nèi)加入不同濃度的FAC(100、200、400 μmol/L)培養(yǎng)12、24、48 h后觀(guān)察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)，消化細(xì)胞后行臺(tái)盼藍(lán)染色。根據(jù)此步驟結(jié)果選取FAC的最佳作用濃度和時(shí)間來(lái)處理MSCs，利用不穩(wěn)定鐵可以淬滅鈣熒光素乙酰氧基甲酯(calcein-acetoxymethylester，calcein-AM)的原理，依據(jù)參考文獻(xiàn)［8］的方法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)不穩(wěn)定鐵池 (labile iron pool，LIP)的含量:用胰酶消化細(xì)胞，PBS洗滌2次后重懸細(xì)胞于PBS中，加入calcein-AM，使其終濃度為0.125 μmol/L，37℃避光溫育15 min，用PBS洗滌2次后，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度值 (mean fluorescence intensity，MFI)。

ROS的測(cè)定 2'，7'-二氯熒光黃雙乙酸鹽 (dichlorofluorescin diacetate，DCFH-DA)為非熒光脂類(lèi)可滲透性成分，能被細(xì)胞內(nèi)的ROS氧化生成非滲透性熒光成分DCF，故DCF的熒光強(qiáng)度與細(xì)胞內(nèi)ROS水平成正比。本實(shí)驗(yàn)采用參考文獻(xiàn) ［9］的方法，在此基礎(chǔ)上略加改進(jìn):將MSCs以1×105/ml的密度接種于六孔板上，分別加入100、200、400 μmol/L FAC處理細(xì)胞后，PBS洗滌2次，加入 DCFH-DA，使其終濃度為10 μmol/L，處理細(xì)胞15 min后洗滌3次，直接在熒光顯微鏡下觀(guān)察各組熒光的強(qiáng)弱。每孔加入細(xì)胞裂解液700 ul，37℃搖床裂解細(xì)胞10 min后將混勻的裂解液加入到96孔板中，用熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)熒光強(qiáng)度 (激發(fā)波長(zhǎng)為488 nm，吸收波長(zhǎng)為530 nm)，結(jié)果采用Gene5軟件進(jìn)行分析。

MSCs的群體倍增時(shí)間 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MSCs，以4×104/孔的密度接種于12孔板上，在37℃溫箱中培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞達(dá)到80%～90%融合時(shí)，用胰酶消化傳代。按以下公式計(jì)算MSCs的倍增時(shí)間 (doubling time，DT):DT=CT×log2/log(X1/X0)，其中X0是細(xì)胞最初的數(shù)量，X1是細(xì)胞最終的數(shù)量，CT是細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間。

Annexin V-PI雙標(biāo)法檢測(cè)細(xì)胞凋亡 按照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行操作，用不含EDTA的胰酶消化MSCs，用PBS洗滌細(xì)胞2遍，懸于結(jié)合緩沖液，調(diào)整細(xì)胞密度至1×106/ml。取400 μl細(xì)胞懸液于流式管中，加入5 μl Annexin V-FITC 4℃避光孵育15 min后，再加入10 μl碘化丙啶 (propidium iodide，PI)在4℃下避光孵育5 min，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

Western blot檢測(cè) 收集1×106個(gè) MSCs，用預(yù)冷的PBS洗滌2遍，冰上裂解細(xì)胞，提取總蛋白。將提取的蛋白以30～100μg的上樣量行聚丙烯酰胺凝膠電泳，然后轉(zhuǎn)移到聚二氟乙烯膜上，用含5%牛血清蛋白的TBST緩沖液室溫封閉1 h后，4℃過(guò)夜，分別孵育兔單抗AKT、P-p38MAPK、p38MAPK、α-微管蛋白 (1∶1000)和兔多抗p53(1∶250)，洗膜后室溫下以 HRP-鼠抗兔抗體 (1∶5000)孵育2 h?？乖贵w復(fù)合物采用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法顯色，暗室X膠片曝光后采用Image-Pro Plus圖像分析軟件分析蛋白條帶的灰度值，將目的蛋白與內(nèi)參α-微管蛋白的灰度值比值作為相對(duì)表達(dá)水平行半定量分析。

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

MSCs的形態(tài)及免疫表型 原代培養(yǎng)的MSCs最初呈圓形，24 h后開(kāi)始有少量細(xì)胞貼壁，培養(yǎng)5 d后貼壁細(xì)胞明顯增多，呈梭形。培養(yǎng)14 d后細(xì)胞達(dá)到完全融合，以1∶2比例傳代，傳3代后細(xì)胞形態(tài)均一，呈纖維漩渦狀貼壁生長(zhǎng) (圖1)。經(jīng)流式細(xì)胞儀直接免疫標(biāo)記法檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)第3代的MSCs中極少細(xì)胞表達(dá)CD34、CD45(陽(yáng)性率分別為1.45%、1.1%)，絕大多數(shù)細(xì)胞表達(dá) CD90(陽(yáng)性率為96.97%)，MSCs的純度較高 (圖2)。

鐵過(guò)載模型的鑒定 FAC處理濃度為400 μmol/L、時(shí)間為24 h時(shí)活細(xì)胞在95%以上，繼續(xù)加大鐵濃度和作用時(shí)間，活細(xì)胞比例下降，故選用此條件進(jìn)行LIP測(cè)定。結(jié)果顯示，加鐵組MSCs的MFI較對(duì)照組明顯減弱 ［(482.49±20.96)比 (303.88±23.37)，P＜0.05］，因此加鐵組細(xì)胞內(nèi)LIP水平明顯升高 (圖3)。

圖1 MSCs形態(tài)學(xué)觀(guān)察結(jié)果 (×200)Fig 1 Morphology of MSCs(×200)

圖2 MSCs免疫表型鑒定結(jié)果Fig 2 Results of immunophenotying of MSCs

圖3 MSCs細(xì)胞內(nèi)的LIP表達(dá)水平Fig 3 Levels of intracellular LIP in MSCs

鐵過(guò)載增加MSCs內(nèi)ROS的生成 用不同濃度的 FAC(100、200、400 μmol/L)處理 MSCs 24 h后，熒光顯微鏡觀(guān)察到加鐵組熒光強(qiáng)度比對(duì)照組增強(qiáng) (圖4)。采用熒光酶標(biāo)儀對(duì)MSCs內(nèi)ROS進(jìn)行的定量檢測(cè)也發(fā)現(xiàn)鐵過(guò)載組的ROS比對(duì)照組明顯增加，且ROS隨著鐵濃度的增加而增加 (圖5)。

鐵過(guò)載抑制MSCs增殖、誘導(dǎo)其凋亡 結(jié)果顯示，對(duì)照組的MSCs生長(zhǎng)旺盛，符合MSCs的生長(zhǎng)特性，而鐵過(guò)載的MSCs增殖能力明顯下降。對(duì)照組的DT為 (1.20±0.05)d，加鐵處理12、24、48 h組的DT分別為 (1.47±0.11)、(1.80±0.13)、(2.04±0.14)d，鐵過(guò)載組MSCs的DT明顯長(zhǎng)于對(duì)照組 (P均＜0.05)。Annexin V-PI雙標(biāo)法顯示鐵過(guò)載組MSCs的凋亡率明顯高于對(duì)照組的凋亡率 ［(3.51%±1.17%)比 (0.66% ±0.62%)，P＜0.05，圖6］。

鐵過(guò)載MSCs的p38MAPK-p53信號(hào)途徑被激活鐵過(guò)載組MSCs凋亡相關(guān)蛋白P-p38MAPK、p38MAPK、p53的表達(dá)明顯高于對(duì)照組 (P均＜0.05)，而細(xì)胞生存相關(guān)蛋白AKT的表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異 (圖7、表1)。

圖4 鐵過(guò)載對(duì)MSCs內(nèi)ROS水平的影響(DCFH-DA，×100)Fig 4 Effect of iron overload on ROS fluorescence level in MSCs(DCFH-DA， ×100)

圖5 熒光酶標(biāo)儀測(cè)定量分析ROS熒光值Fig 5 Quantification assays of the ROS level by fluorescence plate reader

圖6 鐵過(guò)載對(duì)MSCs凋亡的影響Fig 6 Effect of iron overload on the apoptosis of MSCs

圖7 鐵過(guò)載增加了MSCs內(nèi)p38MAPK、p53信號(hào)傳導(dǎo)因子的表達(dá)Fig 7 Iron overload augmented the expression of p38 MAPK and p53 in MSCs

表 1 Western blot檢測(cè)結(jié)果 (n=3，)Table 1 Results of Western blot analysis(n=3，)

表 1 Western blot檢測(cè)結(jié)果 (n=3，)Table 1 Results of Western blot analysis(n=3，)

P-p38MAPK:磷酸化p38絲裂原活化蛋白激酶;AKT:蛋白激酶B;與對(duì)照組比較，aP＜0.05P-p38MAPK:phosphorylated p38 mitogen activated protein kinase;AKT:protein kinase B;aP＜0.05 compared with the control group

組別 Group P-p38MAPK/α-微管蛋白 P-p38MAPK/α-tublin p38MAPK/α-微管蛋白 p38MAPK/α-tublin AKT/α-tublin p53對(duì)照組Control group 0.202±0.024 0.637±0.013 0.721±0.009 0.084±0.011鐵過(guò)載組FAC group 0.346±0.040a 0.746±0.026a 0.689±0.023 0.978±0.071a

討 論

鐵過(guò)載是一種臨床常見(jiàn)病，多見(jiàn)于遺傳性血色病等遺傳因素及紅系無(wú)效造血、長(zhǎng)期輸血等繼發(fā)因素造成的機(jī)體內(nèi)鐵吸收過(guò)多及代謝障礙。多項(xiàng)研究表明鐵過(guò)載患者的骨髓功能明顯抑制，而給予去鐵治療后部分患者血象可恢復(fù)正常，能不依賴(lài)輸血而長(zhǎng)期存活［2］。本研究組的前期研究發(fā)現(xiàn)，鐵過(guò)載的骨髓和臍血造血細(xì)胞內(nèi)ROS明顯升高，細(xì)胞凋亡比例增加，造血功能明顯下降，造血干/祖細(xì)胞比例減低，而這些損傷都可以通過(guò)去鐵治療和抗氧化劑治療部分緩解［3-6］。進(jìn)一步深入研究發(fā)現(xiàn)，鐵過(guò)載不僅影響骨髓造血細(xì)胞的功能，對(duì)MSCs也有明顯的影響。鐵過(guò)載可提高M(jìn)SCs內(nèi)的ROS水平，抑制MSCs增殖、誘導(dǎo)其凋亡，且這些作用可能與p38MAPK-p53信號(hào)通路的激活相關(guān)。

在體外培養(yǎng)MSCs時(shí)給予不同濃度的FAC來(lái)提供游離的Fe3+，鐵可通過(guò)與細(xì)胞膜上的鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白結(jié)合進(jìn)入到細(xì)胞內(nèi)［10］，calcein-AM熒光染料染色法顯示鐵過(guò)載細(xì)胞內(nèi)LIP的水平明顯升高。胞漿內(nèi)聚集的大量自由鐵能轉(zhuǎn)運(yùn)到線(xiàn)粒體，通過(guò)Fenton反應(yīng)和Haber-Weiss途徑催化生成大量 ROS［11］。本研究利用DCFH-DA探針檢測(cè)了鐵過(guò)載MSCs內(nèi)的ROS，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)ROS水平和FAC的濃度成正相關(guān)，說(shuō)明本研究建立的MSCs鐵過(guò)載模型可誘導(dǎo)ROS的生成，進(jìn)一步證實(shí)了鐵過(guò)載與氧化應(yīng)激的關(guān)系。

ROS可通過(guò)多種信號(hào)途徑抑制MSCs的增殖，誘導(dǎo)其衰老凋亡［12］。許多研究表明，p38MAPK信號(hào)途徑參與了ROS介導(dǎo)的MSCs損傷過(guò)程，它可通過(guò)下調(diào)細(xì)胞周期蛋白、上調(diào)細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)性激酶抑制因子等機(jī)制抑制細(xì)胞周期由G1向S及由G2向M過(guò)渡，從而使MSCs的增殖能力下降［13］。經(jīng)線(xiàn)粒體途徑和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激激活的p38MAPK還可調(diào)節(jié)Bax的轉(zhuǎn)移和細(xì)胞色素C的釋放，從而誘導(dǎo)骨髓MSCs的凋亡［14］。與此過(guò)程密切相關(guān)的另一個(gè)信號(hào)因子是p53，該信號(hào)因子可被p38MAPK激活，進(jìn)而作用其下游靶點(diǎn)p21Cip1使細(xì)胞周期停滯，最終降低MSCs的增殖能力，p53還可通過(guò)調(diào)控促凋亡因子和凋亡因子來(lái)誘導(dǎo) MSCs的凋亡［15］。

本研究發(fā)現(xiàn)，處于氧化應(yīng)激狀態(tài)下的鐵過(guò)載組MSCs增殖活性明顯受抑，凋亡率明顯增加，可見(jiàn)該作用很有可能與鐵催化產(chǎn)生的大量ROS有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究ROS相關(guān)信號(hào)通路發(fā)現(xiàn)，鐵過(guò)載的MSCs內(nèi)P-p38MAPK、p38MAPK蛋白的表達(dá)高于對(duì)照組，p53的表達(dá)也升高，提示p38MAPK-p53途徑可能參與了鐵過(guò)載對(duì)MSCs增殖的抑制及對(duì)MSCs凋亡的誘導(dǎo)。AKT信號(hào)途徑在ROS對(duì)MSCs的影響中也起著重要作用，磷酸化的AKT可以激活Bcl-2抗凋亡蛋白，增強(qiáng)MSCs的抗凋亡能力［16］。但是，本研究并未觀(guān)察到AKT蛋白的表達(dá)有明顯變化，有可能是因?yàn)樵诓煌膽?yīng)激條件下，不同的細(xì)胞內(nèi)ROS可激活不同的信號(hào)途徑，而升高的ROS在該過(guò)程中并未激活A(yù)KT來(lái)增加細(xì)胞的抗凋亡能力。還有一種可能是，ROS僅僅通過(guò)提高磷酸化的AKT來(lái)發(fā)揮作用，所以本研究中總AKT蛋白的表達(dá)并無(wú)明顯變化。

ROS是否參與鐵過(guò)載對(duì)骨髓微環(huán)境的影響以及p38MAPK、p53信號(hào)通路是否介導(dǎo)了MSCs的損傷仍需要進(jìn)一步研究，通過(guò)抗氧化治療、去鐵治療、靶向特異的信號(hào)傳導(dǎo)因子及體內(nèi)研究可進(jìn)一步探究其機(jī)制。研究鐵過(guò)載對(duì)造血微環(huán)境的影響不僅有助于發(fā)現(xiàn)臨床治療鐵過(guò)載疾病的新方法 (抗氧化治療)，也對(duì)研究者提出了一個(gè)新的問(wèn)題:如果鐵過(guò)載患者造血功能的下降和MSCs損傷有關(guān)，給予細(xì)胞治療是否能改善患者的造血功能?目前對(duì)這一方面的研究尚處于初步階段，有待進(jìn)一步探索。

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