肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子對(duì)缺氧損傷的肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用

郭 娜，郭英華，蘇龍翔，王雅娟，劉 巖，姜學(xué)革，劉長(zhǎng)庭

中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院南樓呼吸科，北京 100853

肺動(dòng)脈高壓是一種臨床常見病癥，病因復(fù)雜、治療困難、預(yù)后差，嚴(yán)重威脅著患者健康，影響患者生活質(zhì)量。低氧引起血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，血管內(nèi)皮合成和分泌的各種血管舒縮因子平衡失調(diào)導(dǎo)致早期肺血管收縮和后期的肺血管重塑，是導(dǎo)致肺動(dòng)脈高壓的一個(gè)重要機(jī)制［1］。因此，提高肺血管內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)缺氧耐受性、增加損傷后存活率、改善其功能，是防止缺氧導(dǎo)致的肺動(dòng)脈高壓發(fā)生和發(fā)展的關(guān)鍵問題。近年研究發(fā)現(xiàn)，肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子 (hepatocyte growth factor，HGF)是一種特異的促內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子，能提高細(xì)胞生物學(xué)功能及對(duì)抗致病因素?fù)p傷［2-3］。有研究表明，HGF具有強(qiáng)大的促血管生成作用，在肺的形成和肺結(jié)構(gòu)損傷修復(fù)過程中發(fā)揮著重要作用。在利用腹腔注射野百合堿構(gòu)建的大鼠肺動(dòng)脈高壓模型中，HGF能靶向作用于肺小動(dòng)脈并阻止肺動(dòng)脈高壓進(jìn)展，當(dāng)肺動(dòng)脈高壓引起肺血管損傷時(shí)，肺內(nèi)HGF mRNA水平和蛋白濃度下降，而血漿中HGF的水平在第4、第7和第14天代償性升高［4-5］，可見HGF對(duì)于保護(hù)肺血管是必須的。雖然目前已有研究均表明HGF對(duì)于血管內(nèi)皮細(xì)胞具有保護(hù)作用，但在肺微血管內(nèi)皮缺氧損傷方面尚未有實(shí)驗(yàn)證實(shí)。本研究通過HGF作用于缺氧損傷的人肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞 (human pulmonary microvascular endothelial cells，HPMECs)后，觀察損傷后HPMECs的存活率、體外培養(yǎng)時(shí)細(xì)胞的貼壁能力，檢測(cè)細(xì)胞間黏附分子-1(intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1)表達(dá)的改變，旨在為探索缺血性肺動(dòng)脈高壓的發(fā)病機(jī)制及藥物治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材料和方法

主要材料和試劑 HPMECs細(xì)胞株購(gòu)自美國(guó)Sciencell公司，ECM培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)GIBCO公司，澳洲胎牛血清購(gòu)自瑞士Lonza公司，胰酶購(gòu)自美國(guó)Sciencell公司，人重組肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子 (rhHGF)購(gòu)自美國(guó)Peprotechasia公司，PHA665752購(gòu)自美國(guó)Selleck公司，兔抗人vWF抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司，F(xiàn)ITC標(biāo)記山羊抗兔IgG、ICAM-1抗體和二抗兔抗小鼠抗體購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，二氧化碳培養(yǎng)箱購(gòu)自三洋公司。

HPMECs體外培養(yǎng) HPMECs接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中，用ECM培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，500 ml ECM培養(yǎng)基中添加青霉素/鏈霉素5000 U，胎牛血清50 ml。每2～3d換液1次，待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%融合時(shí)用胰酶消化法，按1∶2(體積比)分瓶傳代，用第6～8代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。將HPMECs接種在2.55 cm×2.15 cm大小的蓋玻片上，爬片24 h后，換細(xì)胞培養(yǎng)液1次，待其生長(zhǎng)至30%融合時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。HPMECs在37℃、5%(體積分?jǐn)?shù))CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

HPMECs的鑒定 將第7代HPMECs接種在2.55 cm×2.15 cm大小的蓋玻片上，待其生長(zhǎng)至30%融合時(shí)取出蓋玻片，PBS漂洗3次，每次5 min，4%(體積分?jǐn)?shù))多聚甲醛固定30 min后再以PBS漂洗 (方法如前)，隨后用0.2%(體積分?jǐn)?shù))TritonX-100通透細(xì)胞2 min并用山羊血清封閉20 min后，加入兔抗人vWF(體積比1∶50)，室溫下一抗孵育2 h后4℃過夜。次日用PBS漂洗3次，加入FITC標(biāo)記的二抗 (體積比1∶50)室溫下孵育1 h，最后用甘油封片，熒光顯微鏡下觀察并拍照。

構(gòu)建缺氧損傷模型 按實(shí)驗(yàn)分組處理細(xì)胞并待細(xì)胞貼壁后，將細(xì)胞放入特制容器中，容器外接兩根管道，其中一根管道進(jìn)氣，另一根管道出氣，向進(jìn)氣口中持續(xù)通入含5%CO2、0～5%(體積分?jǐn)?shù))O2的混合氣體，并將出氣口通入水中防止外界O2進(jìn)入容器中，容器其他部位均密封。將容器放入水浴鍋中，調(diào)節(jié)水浴鍋溫度，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)容器中實(shí)際溫度，保證容器中溫度為 (37±2)℃。

rhHGF對(duì)HPMECs存活率的影響 選擇4～7代細(xì)胞，胰蛋白酶消化后制成單細(xì)胞懸液，以2×103個(gè)/孔的密度接種于96孔板上，次日換無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，隨后按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)分4組:第1組為空白對(duì)照組，細(xì)胞于37℃、5%CO2、常規(guī)O2培養(yǎng);第2組為陰性對(duì)照組，細(xì)胞于37℃、5%CO2，0～5%O2下培養(yǎng);第3組為HGF組，向細(xì)胞培養(yǎng)基中加入不同質(zhì)量濃度的 HGF(10、30、50、80、100μg/L)，將細(xì)胞于37℃、5%CO2，0～5%O2下培養(yǎng);第4組為PHA組 (HGF阻斷劑組)，向細(xì)胞培養(yǎng)基中加入濃度為5 μmol/L的HGF阻斷劑PHA665752，將細(xì)胞于37℃、5%CO2，0～5%O2下培養(yǎng)。24 h后向各實(shí)驗(yàn)組中加入 MTT溶液 (質(zhì)量濃度 5 g/L)20 μl，37℃下孵育4 h后吸除上清液，每孔加入150 μl DMSO，震蕩10 min使結(jié)晶充分溶解。在酶標(biāo)儀上以490 nm波長(zhǎng)測(cè)定各孔光密度 (D)值。存活率=(D實(shí)驗(yàn)組－D空白對(duì)照組)/D空白對(duì)照組×100%。每組設(shè) 3 個(gè)復(fù)孔，重復(fù)3次。

rhHGF對(duì)HPMECs體外培養(yǎng)貼壁能力的影響選擇4～7代細(xì)胞，胰蛋白酶消化后制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為1×104個(gè)/ml，將細(xì)胞懸液500 μl接種在24孔板中，按實(shí)驗(yàn)分組，分別設(shè)立空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組、HGF組 (50μg/L)和 PHA665752(5 μmol/L)組。37℃、5%CO2培養(yǎng)1 h后棄去上清液，隨機(jī)選取3個(gè)高倍鏡視野 (200倍)計(jì)數(shù)貼壁細(xì)胞，每個(gè)組各設(shè)3個(gè)復(fù)孔。

rhHGF對(duì)HPMECs表達(dá)ICAM-1的影響 選擇4～7代細(xì)胞，將細(xì)胞培養(yǎng)在25 cm2培養(yǎng)瓶中，待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)至80%融合后，更換無血清培養(yǎng)基，每瓶3 ml，饑餓培養(yǎng)24 h后，按實(shí)驗(yàn)分組處理細(xì)胞，分別設(shè)立空白對(duì)照組、缺氧損傷組、HGF組 (50μg/L)和PHA665752(5 μmol/L)組，向培養(yǎng)瓶中加入等體積 (4 ml/瓶)的添加干預(yù)成分的細(xì)胞培養(yǎng)基，待培養(yǎng)24 h后按照RIPA法提取蛋白，隨后采用Western blot法檢測(cè)ICAM-1的表達(dá)。采用蛋白質(zhì)聚丙烯酰胺凝膠 (SDS-PAGE)電泳、轉(zhuǎn)膜、免疫化學(xué)發(fā)光，拍照，Quantity one軟件進(jìn)行條帶灰度分析。

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間比較采用ANOVA檢驗(yàn)，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

HPMECs的體外培養(yǎng)和鑒定 體外HPMECs能穩(wěn)定傳代，細(xì)胞傳代時(shí)經(jīng)胰蛋白酶消化后成圓球形，吹打后可從培養(yǎng)瓶壁上脫落，12 h后細(xì)胞可貼壁，細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征見圖1～2。

圖1 人肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞在普通光學(xué)顯微鏡下成像 (×100)Fig 1 Normal human pulmonary microvascular endothelial cells under the ordinary optical microscope(×100)

圖2 人肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞經(jīng)FITC-vWF染色后，同一視野熒光顯微鏡下成像 (×100)Fig 2 The fluorescent microscopy of human pulmonary microvascular endothelial cells after stained with fluorescein isothiocyanate conjugated rabbit anti-vWF antibody(×100)

構(gòu)建缺氧損傷模型 所構(gòu)建缺氧損傷模型，保證除氧氣體積分?jǐn)?shù)以外的其他條件 (CO2體積分?jǐn)?shù)、溫度、濕度等)與空白對(duì)照組一致。

細(xì)胞存活率檢測(cè)結(jié)果 10、30、50、80、100μg/L HGF組的細(xì)胞存活率分別為0.528±0.029、0.521±0.021、0.518±0.021、0.518±0.021、0.513±0.019，均明顯高于缺氧損傷組的－0.171±0.032(P均＜0.01)，但各HGF濃度組間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P均＞0.05);當(dāng)用HGF阻斷劑PHA665752(5 μmol/L)干預(yù)后，其細(xì)胞存活率為－0.274±0.050，明顯低于缺氧損傷組和各HGF濃度組 (P均＜0.01)。

HPMECs貼壁率的測(cè)定結(jié)果 按實(shí)驗(yàn)分組處理細(xì)胞后，隨機(jī)選取3個(gè)高倍鏡視野計(jì)數(shù)貼壁細(xì)胞，結(jié)果顯示缺氧損傷組細(xì)胞貼壁率為7.111±2.369，明顯低于50μg/L HGF組的17.111±3.790(P ＜0.001)，明顯高于PHA組的2.556±1.944(P＜0.001)，與空白對(duì)照組的8.667±2.121差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＞0.05)。

ICAM-1表達(dá)的測(cè)定結(jié)果 按實(shí)驗(yàn)分組處理細(xì)胞后，提取蛋白，檢測(cè)ICAM-1的表達(dá)，結(jié)果顯示缺氧損傷組、50μg/L HGF組和PHA組的ICAM-1表達(dá)量分為1.141±0.072、1.123±0.134和1.267±0.248，均明顯高于空白對(duì)照組的0.671±0.119(P均 ＜0.01)，50μg/L HGF組和 PHA 組的 ICAM-1表達(dá)量均明顯低于缺氧損傷組 (P均＜0.01)。

討 論

目前，肺動(dòng)脈高壓的治療雖然取得較大進(jìn)展，但是病死率仍然很高，而且并不能達(dá)到完全治愈的目的。肺移植術(shù)雖然可達(dá)到根治目的，但基于其移植供體不易獲得、排異反應(yīng)以及費(fèi)用高等缺陷，僅能有少數(shù)患者獲益。因此，無論是對(duì)于臨床工作還是科學(xué)研究，開發(fā)有效的治療藥物都是必須的。

HGF又稱擴(kuò)散因子，是由相對(duì)分子質(zhì)量為69×103的α亞基和34×103的β亞基通過二硫鍵組成的有活性的異源二聚體［6］，細(xì)胞膜表面的 c-Met蛋白是HGF的特異性受體，PHA665752是c-Met受體抑制劑，可以抑制其生物學(xué)作用［7］。有研究表明，HGF通過與c-Met受體結(jié)合，催化底物蛋白的磷酸化，將細(xì)胞外的信息轉(zhuǎn)導(dǎo)到細(xì)胞內(nèi)部，構(gòu)成HGF/c-Met信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。目前研究發(fā)現(xiàn)，HGF可以刺激多種不同類型的細(xì)胞發(fā)生生物學(xué)效應(yīng)，主要包括:促進(jìn)牛視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞增生和移行［8］、促進(jìn)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和毛細(xì)血管形成［9-11］、促進(jìn)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞合成NO從而增強(qiáng)內(nèi)皮細(xì)胞的活力［12］、促進(jìn)干細(xì)胞的定向移動(dòng)并誘導(dǎo)其分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞［13］。本研究采用HGF作用于缺氧損傷的HPMECs，觀察損傷后HPMECs存活率、體外培養(yǎng)時(shí)細(xì)胞的貼壁能力及檢測(cè)ICAM-1表達(dá)的改變，以期從細(xì)胞水平進(jìn)一步探討HGF對(duì)缺氧損傷HPMECs的保護(hù)作用，為探索缺血性肺動(dòng)脈高壓的發(fā)病機(jī)制和藥物治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

血管內(nèi)皮的完整性不僅依賴于減少細(xì)胞死亡，更重要的在于保持血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖與細(xì)胞死亡的動(dòng)態(tài)平衡，因此，有效提高內(nèi)皮細(xì)胞的存活率有利于損傷內(nèi)皮修復(fù)。研究表明，HGF可促進(jìn)臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖［9］，同時(shí)在HGF作用下，肺癌細(xì)胞A549形成的病灶具有明顯的毛細(xì)血管誘生作用［10］。本研究中，HGF可以顯著提高缺氧損傷HPMECs的存活率，當(dāng)用HGF特異性受體阻斷劑PHA665752阻斷HGF作用后，細(xì)胞存活率較HGF干預(yù)組和缺氧損傷組顯著下降，可見HGF是有效的促進(jìn)HPMECs增殖的細(xì)胞因子，對(duì)于缺氧損傷后HPMECs起到保護(hù)作用，提高了損傷后HPMECs存活率，同時(shí)，一旦HGF通路被抑制后，細(xì)胞不僅不能正常增殖，其損傷程度將進(jìn)一步加重，存活率較單純損傷組顯著下降。

以往大量研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞培養(yǎng)過程中，細(xì)胞狀態(tài)良好時(shí)，細(xì)胞貼壁的效率高，細(xì)胞貼壁后形態(tài)更加規(guī)則，細(xì)胞與細(xì)胞之間的差異性更小。國(guó)內(nèi)外學(xué)者運(yùn)用體外差速貼壁法來分離純化細(xì)胞，細(xì)胞的貼壁速度與物理性狀和成熟度密切相關(guān)［14］。本研究發(fā)現(xiàn)，在缺氧損傷時(shí)HPMECs貼壁能力較空白對(duì)照組有所下降;HGF干預(yù)后，HPMECs的貼壁能力較缺氧損傷組明顯增強(qiáng);用特異性阻斷劑PHA665752阻斷HGF的作用后，HPMECs貼壁能力明顯下降。由此可見，HGF使HPMECs處于良好的生長(zhǎng)狀態(tài)下，為細(xì)胞生長(zhǎng)提供了適宜的微環(huán)境，內(nèi)皮細(xì)胞本身也可以分泌少許的HGF，當(dāng)阻斷HGF通路后，細(xì)胞貼壁率下降，細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)受到影響。HGF對(duì)于保證HPMECs正常生長(zhǎng)是必須的，并且在給予外源性HGF后其貼壁率較正常對(duì)照組升高。

ICAM-1是一種免疫球蛋白超家族類的細(xì)胞表面黏附分子，基因定位于19號(hào)染色體上，在血管內(nèi)皮細(xì)胞上表達(dá)最強(qiáng)，是活化血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)的重要黏附分子［15］。ICAM-1是炎癥反應(yīng)的可信標(biāo)志物［16］，在細(xì)胞表面的表達(dá)量可反映損傷病變的嚴(yán)重程度［17］。同時(shí)，ICAM-1作為重要炎性介質(zhì)在肺部炎癥反應(yīng)中起重要作用，其表達(dá)水平與肺損傷程度密切相關(guān)［18］。已有研究表明，ICAM-1促進(jìn)多型核白細(xì)胞在肺內(nèi)聚集并刺激其釋放彈性蛋白酶和其他水解酶，加重肺組織損傷［19］，因此，通過下調(diào)ICAM-1的表達(dá)水平來減輕肺損傷是一種行之有效的方法。本研究結(jié)果顯示，正常HPMECs有少量ICAM-1表達(dá)，缺氧損傷時(shí)ICAM-1的表達(dá)量較空白對(duì)照組明顯升高，HGF可抑制ICAM-1表達(dá)，當(dāng)HGF作用被阻斷后，ICAM-1表達(dá)升高，說明HGF可以抑制HPMECs表面炎癥介質(zhì)表達(dá)，抑制損傷發(fā)生。

綜上，本研究從細(xì)胞水平探討了HGF對(duì)缺氧損傷HPMECs的保護(hù)作用，缺氧損傷過程中，炎癥反應(yīng)標(biāo)志物ICAM-1被激活，引起HPMECs結(jié)構(gòu)和功能的損傷，使細(xì)胞增殖能力受損，貼壁能力下降。HGF通過抗炎癥因子作用 (包括減少ICAM-1的表達(dá))而增加了HPMECs存活率，提高體外培養(yǎng)時(shí)細(xì)胞的貼壁率，從而減輕缺氧損傷所造成的HPMECs損傷，對(duì)肺動(dòng)脈高壓的防治發(fā)揮了重要的作用。

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