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    中藥復方對豬大腸桿菌的體外抑菌活性研究

    2013-08-08 13:39:34王俊麗張要齊孫雪峰張新蕾
    中獸醫(yī)學雜志 2013年1期
    關鍵詞:組方黃柏試管

    王俊麗 ,張要齊 ★,,孫雪峰 ,張新蕾 ,史 柯

    (1.河南惠通天下生物工程有限公司,河南新鄭 451162;2.河南惠通天下動物藥業(yè)有限公司,河南鄭州 450008)

    豬大腸桿菌病是由致病性大腸桿菌引起的腸道傳染病,主要表現(xiàn)為仔豬黃白痢和水腫病,隨著集約化養(yǎng)豬方式的日益加大,該病呈上升趨勢,已成為仔豬死亡的主要原因之一。目前臨床上常用抗生素進行治療,雖然具有一定的療效,但往往存在易產(chǎn)生耐藥性及畜產(chǎn)品藥物殘留等問題,不僅影響到治療效果而且還危害人類健康[1,2]。中藥以其本身來源的廣泛性、成本低廉、毒副作用小、且不易產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)點在獸醫(yī)臨床受到重視,近年來,對于單味中藥對豬大腸桿菌抑菌活性的研究報道很多[3-5],但往往存在有效成分單一、作用不明顯等問題,本研究在前續(xù)試驗的基礎上篩選了7個中藥組方,并通過試管二倍稀釋法和管碟法對其體外抑菌活性進行研究,旨在篩選出抗大腸桿菌的最佳組方,為臨床治療仔豬大腸桿菌病提供參考。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 藥物 中藥復方1:黃連、黃柏、白術、黨參、赤石脂;復方2:黃連、黃柏、魚腥草、金銀花、赤石脂;復方3:黃連、黃柏、白術、防風、赤石脂;復方4:黃柏、穿心蓮、金銀花、連翹、赤石脂;復方5:黃連、黃柏、黃芪、白頭翁、赤石脂;復方 6:黃連、防風、白術、黨參、赤石脂;復方7:黃連、黃柏、板藍根、魚腥草、赤石脂。

    1.1.2 供試菌株豬大腸桿菌由河南科技學院微生物實驗室提供,所有菌種置于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.1.3 供試菌株培養(yǎng)基(1)普通肉湯培養(yǎng)基:牛肉浸膏 3g、蛋白胨 10g、NaCl 5g、純化水至1000ml,pH值 7.2~7.4;(2)普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基:蛋白胨 10g,牛肉膏 3g,NaCl5g,瓊脂 20g,純化水至1000ml,pH值7.2~7.4。配制后高壓滅菌后4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.2 方法

    1.2.1 藥液的煎制:每個組方按比例混合,稱取適量裝入三角燒瓶中,加10倍量水浸泡2h,電爐加熱微沸2h,8層紗布過濾,藥渣再加8倍量水煮沸1h,過濾后合并2次濾液,離心過濾、濃縮至終濃度為1g/ml。調pH7.3,分裝,高壓滅菌,4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.2.2 菌液制備:菌種接種于普通瓊脂培養(yǎng)基上,37℃培養(yǎng)24h,挑取典型菌落接種于新鮮肉湯培養(yǎng)基中,37℃培養(yǎng)18h,備用。

    1.2.3 18種中藥最小抑菌濃度(MIC)的測定[6]

    采用試管二倍稀釋法:(1)取滅菌有棉塞試管11支并編號,每管先加入無菌肉湯培養(yǎng)基2.0ml,于第一管中加入滅菌的受試復方中藥水提物2.0ml,混勻后取出2.0ml放入第2管中,依次梯度稀釋直到第9管取出2.0m l棄去,第10管不加藥物,作為陽性對照,第11管加受試復方中藥水提物2.0ml,混勻后取出2.0ml棄去,不加細菌,作為陰性對照。各管平行3份。(2)經(jīng)肉湯培養(yǎng)基培養(yǎng)18h的試驗菌液用無菌肉湯稀釋100倍。取細菌稀釋液0.1ml分別加入上述1~10管中混勻,11號管加0.1ml滅菌生理鹽水,置各管于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h,觀察結果。在陽性對照管細菌生長呈混濁狀,而陰性對照管無細菌生長呈透明狀的前提下,觀察其他試管的混濁情況。如試管內混濁,說明有細菌生長;如試管內澄清透明,證明無細菌生長。無細菌生長而含藥液濃度最低者,即為該種藥物對該菌株的最低抑菌濃度。

    1.2.4 18種中藥最小殺菌濃度(MBC)的測定

    取MIC終點濃度以上未生長細菌的各稀釋管內培養(yǎng)物0.1ml,接種于瓊脂平板培養(yǎng)基上,于恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h,觀察有無細菌生長,培養(yǎng)基中無細菌生長的最低濃度即為受試中藥水提物的最低殺菌濃度。

    1.2.5 藥物敏感試驗

    采用管碟法:將滅菌后的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基傾入滅菌培養(yǎng)皿內,放置凝固用作底層培養(yǎng)基。用無菌吸管吸取大腸桿菌培養(yǎng)液(稀釋為106cfu/ml)0.1m l,滴于底層培養(yǎng)基上,用無菌棒將菌液涂勻,待表面干燥后,用無菌鑷子在每個平皿中等距離放置3個牛津杯,用滴管分別將藥液加到牛津杯中,以滴滿為度,蓋上平皿蓋。然后將滴加藥液的平皿水平置恒溫箱內,37℃培養(yǎng)18~24h,用游標卡尺測量抑菌圈直徑。抑菌圈直徑>20mm為高敏,抑菌圈直徑15~20為中敏,抑菌圈直徑<15mm為低敏,無抑菌圈為不敏感[4]。

    2 結果與分析

    2.1 試管二倍稀釋法測定各復方中藥的體外抑菌試驗結果

    結果見表1。

    表1 各復方中藥的體外最低抑菌濃度和最低殺菌濃度試驗結果

    由表1可知,復方1和復方3對豬大腸桿菌的抑菌效果較好,MIC值和MBC值均為15.63mg/ml和62.5mg/ml;其次是復方5和復方4,復方 5MIC值和 MBC值為 31.25mg/m l和62.5mg/ml,復方 4MIC值和 MBC值均為62.5mg/ml。而復方2、復方6和復方7抑菌效果不明顯,MIC值和MBC值相對較高。

    2.2 管碟法測定各復方中藥的體外抑菌試驗結果

    結果見表2。

    由表2可以看出,復方1和復方3的平均抑菌圈直徑相對較大,分別為15.20mm和17.99mm,抑菌強度均為中敏;其他幾個復方抑菌強度相對較低,均為低敏。

    表2 各復方中藥的藥敏試驗結果

    3 討論

    中藥復方研究是中醫(yī)藥現(xiàn)代化研究的重點與難點之一,也是中醫(yī)辨證論治理論精髓的具體體現(xiàn),它是在辨證審因決定治法以后,選擇合適的藥物酌定用量,按照組成原則妥善配伍而成的一組藥物,其所含化學成分復雜,藥理作用具有多靶點、多層次的特點[7]。本研究在前續(xù)單味中藥體外抑菌試驗的基礎上,結合中藥復方之特點以及仔豬腹瀉的中獸醫(yī)理論完成組方,整個處方篩選過程嚴格遵循科學性原則。按中獸醫(yī)辨證理論,大腸桿菌病為濕熱壅積腸道而引起的里熱證,宜清熱解毒、燥濕止痢[8]。早先就有報道顯示,清熱藥絕大部分具有抑菌作用[9]。部分研究者以清熱解毒、清熱燥濕為藥物篩選方向,尋找專門針對致病性大腸桿菌的單味中藥與組方[10]。本研究從抗菌消炎、清熱燥濕、瀉火解毒、健脾理氣、勝濕止痛、澀腸止瀉等方面入手,結合獸醫(yī)臨床實踐,按照中獸醫(yī)理、法、方、藥的基礎理論進行組方,并通過其對豬大腸桿菌的體外抑菌活性篩選最佳組方。

    本研究結果顯示,復方1和復方3在試管二倍稀釋法和管碟法中均表現(xiàn)較好的抑菌效果,兩個組方MIC值和MBC值相同,從二者抑菌強度來看,復方3比復方1平均抑菌圈直徑較大,但二者均在中敏抑菌強度范圍之內。從二者復方組份分析,兩個復方均含有黃連、黃柏、白術和赤石脂,整個復方僅為防風和黨參之間的差異,從二藥藥理功效來看黨參補中益氣、健脾生津,與白術是常配藥[11];防風勝濕止痛,止痙定搐,古方中常用防風作為痛瀉藥方的引經(jīng)之要藥,其能舒脾瀉肝加之白術的燥濕健脾,二者相配可以補脾土而瀉肝木,調氣機以止痛瀉。鑒于中藥古方之精髓以及良好的體外抑菌效果,本研究確定復方3為最佳組方。

    [1]沈憲文,吳斌.132株臨床分離仔豬大腸桿菌的耐藥性分析[J].吉林農業(yè)科技學院學報,2007,16(4):1-5.

    [2]任遠明.豬大腸桿菌病的綜合防治[J].國外畜牧學-豬與禽,2011,31(6):77-79.

    [3]陳莉,朱鳳靜,張春枝.30種中藥水提取物的體外抗菌活性試驗[J].大連輕工業(yè)學院學報,2005,24(4):269-271.

    [4]陳薇,曾艷,賀月林,等.20種中草藥體外抑菌活性研究[J].中獸醫(yī)醫(yī)藥雜志,2010,3:34-36.

    [5]鄔蘇曉,肖正中,李淑儀.20種中草藥水提物的體外抑菌試驗[J].安徽農業(yè)科學,2008,36(19):8104-8105.

    [6]張興,鄧淑華,佟繼銘.滿藥赤雹果揮發(fā)油體外抑菌活性研究[J].時珍國醫(yī)國藥2011,22(5):1089-1090.

    [7]路曉欽,高月.中藥復方現(xiàn)代化藥理研究方法進展[J].中藥新藥與臨床藥理,2002,13(1):59-61.

    [8]中國獸藥典委員會.中華人民共和國獸藥典(二部)[M].北京:中國農業(yè)出版社,2010.

    [9]山東醫(yī)學院微生物學教研室組.110種中藥抗菌譜試驗的初步結果[J].山東醫(yī)學院學報,1959,7(2):42-45.

    [10]褚秀玲,蘇建青,韋旭斌.中藥抗大腸桿菌病研究進展[J].安徽農業(yè)科學,2008,36(21):9093-9094,9114.

    [11]于船.中獸醫(yī)學(第二版)[M].北京:中國農業(yè)出版社,2001,252-254.

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