李斯特屬細菌特征揮發(fā)性代謝物的鑒定分析

陳 雪，倪 鵬，喻勇新，潘迎捷，趙 勇,*

(1.上海海洋大學食品學院，上海 201306；2.上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心，上海 201306；3.南通出入境檢驗檢疫局，江蘇 南通 226018)

2010年的食品安全問題中，由食源性致病菌引起的事件數(shù)和中毒人數(shù)分別占總數(shù)的36.82%和62.10%[1]。最近，在美國暴發(fā)李斯特屬細菌(Listeria spp.)感染疫情，截至2011年10月2日，致17人死亡，84人染病。因此，對食源性致病菌的檢測己迫在眉睫。微生物氣味指紋技術(shù)作為一種快速、簡便和無損的方法，在微生物的分類、鑒別和檢測上的研究逐漸興起。微生物在生長過程中利用了環(huán)境中的營養(yǎng)物質(zhì)，在酶的作用下產(chǎn)生了揮發(fā)性代謝產(chǎn)物，由于個體不同，其代謝方式和途徑也不盡相同，所釋放的揮發(fā)性代謝產(chǎn)物的時間、數(shù)量、種類也有差別，這些差別構(gòu)建了微生物的氣味化學條碼。此條碼可以潛在的被用來作為微生物鑒定與檢測的依據(jù)[2-3]。

近年來越來越多的研究者報道了基于氣味指紋技術(shù)在微生物檢測中的應用，但是系統(tǒng)的分析揮發(fā)性代謝產(chǎn)物鮮有報道。在國外，有學者對一些細菌所產(chǎn)生的類似馬鈴薯氣味進行了研究[4]；結(jié)合神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)分析大腸桿菌的揮發(fā)性代謝產(chǎn)物[5]；用手提式電子鼻系統(tǒng)識別了牛肉中培養(yǎng)的沙門氏菌[6]；建立了一種快速預測包裝的新鮮蔬菜中食源性致病菌的含量的方法[7]。比起細菌更早的是用于對真菌的研究[8-10]。在國內(nèi)，氣味指紋技術(shù)在微生物檢測上的應用相對較少，僅用于分析一些細菌的代謝產(chǎn)物及特定物質(zhì)的含量[11-14]。本實驗室對氣味指紋技術(shù)的研究以及在微生物檢測上的應用具有一定的實驗基礎(chǔ)。實驗人員通過電子鼻技術(shù)成功區(qū)分3種細菌(蠟樣芽孢桿菌、單增李斯特菌、緩慢葡萄球菌)[15]，且進一步對單增李斯特菌培養(yǎng)不同時間后的揮發(fā)性代謝產(chǎn)物進行了分析，發(fā)現(xiàn)該菌在生長8h后產(chǎn)生特有的揮發(fā)性物質(zhì)[16]；還對一株分離自南美白對蝦的副溶血性弧菌與3株分離自豬肉中的假單胞菌進行研究。結(jié)果顯示副溶血性弧菌經(jīng)純培養(yǎng)后，產(chǎn)生了明顯區(qū)別于空白純培養(yǎng)液的揮發(fā)性代謝產(chǎn)物；3株假單胞菌的揮發(fā)性代謝產(chǎn)物之間存在著差異，并列出相對應的特有物質(zhì)[17-18]。以上結(jié)果均能證實氣味化學條碼可以被用來鑒定與檢測微生物。

本實驗采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)與電子鼻技術(shù)對5種常見李斯特屬細菌的揮發(fā)性代謝產(chǎn)物進行了定性及相對定量的分析研究，得到5株細菌特有的氣味化學條碼，輔以電子鼻驗證其區(qū)分結(jié)果。實驗結(jié)果有望為今后微生物氣味指紋庫的建立提供數(shù)據(jù)支持，從而建立一種快速、簡便、無損的食源性致病菌新型檢測系統(tǒng)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

腦心浸液肉湯(BHI，每升培養(yǎng)基中含有牛腦200.0g、牛心浸出汁250.0g、蛋白胨10.0g、葡萄糖2.0g、NaCl 5.0g、瓊脂20.0g) 英國Oxoid公司；固相微萃取裝置、萃取頭(50/30μm DVB/CAR/PDMS) 美國Supelco公司。

GCMS-QP2010 Ultra氣相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用儀 日本島津公司；Fox-4000 Sensory Array Fingerprint電子鼻(E-nose) 法國Alpha MOS公司。

1.2 樣品處理

實驗菌株如表1所示。

表1 實驗菌株Table 1 Five species of Listeria

檢測樣品制備：將斜面保藏的菌種接種到8mL BHI液體培養(yǎng)基中，于37℃、180r/min的條件下?lián)u床培養(yǎng)(種子液)備用。

GC-MS檢測：取稀釋一定梯度的1.5mL種子液于裝有13.5mL液體培養(yǎng)基的40mL頂空樣品瓶中，置于37℃、180r/min的條件下?lián)u床培養(yǎng)8h，用于GC-MS檢測，每組樣品3個平行。

電子鼻檢測：取20μL的種子液于裝有2mL液體培養(yǎng)基的10mL頂空樣品瓶中，置于37℃、180r/min條件下?lián)u床培養(yǎng)8h，用于電子鼻檢測，每組樣品5個平行。

1.3 檢測方法

1.3.1 固相微萃取進樣

將培養(yǎng)后的樣品瓶于37℃水浴振蕩，用固相微萃取纖維頭萃取35min后，纖維頭插入進樣口解吸5min進樣。

1.3.2 色譜質(zhì)譜條件

色譜柱：Rxi-5 Sil MS(30m×0.25mm，0.25μm)；SPL進樣口溫度：250℃；不分流進樣，進樣時間：1min；柱溫程序：30℃保持3min，以5℃/min升至160℃，再以13℃/min升至250℃；柱流量：1.0mL/min恒線速度方式；接口溫度：280℃；離子源溫度：230℃；采集方式：掃描m/z 30～400。

1.3.3 電子鼻條件

頂空樣品進樣(由進樣器自動完成)：加熱箱溫度37℃，振蕩速度500r/min，每個樣品加熱600s；分析條件：以合成的干燥空氣為載氣，流速150mL/min，注射體積2.5mL，注射針溫度47℃，注射針總體積2.5mL，注射速度2.5mL/s，獲取時間120s，延滯時間600s[15-16]。

1.4 數(shù)據(jù)處理方法

利用Origin軟件作圖，并運用PAST軟件中主成分分析法(PCA)與聚類分析法。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品總揮發(fā)性代謝產(chǎn)物

5株菌的揮發(fā)性代謝物總離子流色譜圖如圖1所示。

圖 1 5種李斯特屬菌揮發(fā)性代謝產(chǎn)物的總離子流圖Fig.1 Total ion chromatograms of volatile compounds from five Listeria spp.

由圖1可見，5種李斯特屬細菌在原始色譜圖上具有差異。通過計算其皮爾森系數(shù)(Pearson correlation coefficient)的絕對值，進一步比較5種菌的相關(guān)性，其絕對值越大表明相關(guān)性越強，結(jié)果見表2。除了格氏李斯特菌和綿羊李斯特菌的相關(guān)系數(shù)為0.810以外，其他菌株之間的相關(guān)系數(shù)均小于0.7，可見5株李斯特屬細菌的色譜圖存在著明顯的差異。其中，格氏李斯特菌和威爾士李斯特菌之間的相關(guān)系數(shù)為0.373，兩者的差異最為顯著。

表2 5種李斯特屬菌揮發(fā)性代謝產(chǎn)物的總離子流圖相關(guān)系數(shù)表Table 2 Correlation coefficients for total ion chromatograms of volatile compounds from five Listeria spp.

實驗中GC-MS檢測的每個樣品均有3個平行檢測對象，通過計算平行色譜圖的皮爾森系數(shù)絕對值，進一步評價試驗結(jié)果的穩(wěn)定性，所得平均皮爾森系數(shù)絕對值見表3。由表3可知，5個樣品的平行色譜圖彼此之間的相關(guān)性很高，均在0.890～0.946之間，即相似程度較高。由此可以推斷由GC-MS測得的氣味指紋重現(xiàn)性較好，具有形成區(qū)分、鑒定李斯特菌的氣味條碼的潛在能力。

表3 5種李斯特屬細菌揮發(fā)性代謝產(chǎn)物的總離子流圖平均相關(guān)系數(shù)表Table 3 Pearson coefficients for total ion chromatograms of volatile compounds from five Listeria spp.

通過質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫檢索，確定其化學組成。共得到115種物質(zhì)，并應用峰面積歸一化法測定了它們的相對含量，其結(jié)果見表4。揮發(fā)性成分：空白培養(yǎng)基檢測出48種物質(zhì)，英諾克李斯特菌檢測出59種物質(zhì)，威爾士李斯特菌檢測出53種物質(zhì)，綿羊李斯特菌檢測出52種物質(zhì)，格氏李斯特菌檢測出52種物質(zhì)，單增李斯特菌檢測出67種物質(zhì)。5株李斯特屬菌培養(yǎng)后的揮發(fā)性代謝產(chǎn)物具有一定的差異。

2.2 樣品間共有物質(zhì)

在對6個樣品的檢測中，共得到的揮發(fā)性物質(zhì)有11種。分別為2,3-丁二酮、2-丁酮、異戊醛、羥基丙酮、甲苯、2,5-二甲基吡嗪、甲氧基苯基肟、苯甲醛、2-羥基萘、十四烷、正二十烷。其中除去異戊醛、苯甲醛、十四烷、正二十烷4種物質(zhì)較空白培養(yǎng)基的含量有增有減外，其他共有物質(zhì)的含量均有增加。

在5種菌培養(yǎng)液的檢測中，相對于空白培養(yǎng)基新產(chǎn)生的共有物質(zhì)有6種。分別為乙醇、丙酮、3-羥基-2-丁酮、乙酸丁酯、3-甲硫基丙醛、6-丁基壬烷。

2.3 樣品特有揮發(fā)性代謝產(chǎn)物

從生物分類學角度上比較，5株李斯特菌它們的遺傳信息存在一定的差異，而這種差異可能使不同細菌對培養(yǎng)基分解能力出現(xiàn)差別，代謝途徑不同從而造成其代謝產(chǎn)物不同。

在檢測結(jié)果中也得到了每種菌培養(yǎng)后所獨有的物質(zhì)。英諾克李斯特菌特有物質(zhì)：二硫化碳、D-樟腦、2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚；威爾士李斯特菌特有物質(zhì)：3,4-二甲基己烷、5-甲基癸烷、異十三醇、丁基壬烷、4-甲基十四烷、2-異丙基-5-甲基-2-庚醇、3-甲基十七烷、5-甲基-6-丙基壬烷；綿羊李斯特菌特有物質(zhì)：反-2-庚烯-1-醇、1,3-二氫異苯并呋喃、苯乙醇、左旋樟腦；格氏李斯特菌特有物質(zhì)：氯氟乙酰胺；單增李斯特菌特有物質(zhì)：二甲基硫、3-甲基-2-(3-甲基-2-丁烯基)呋喃、3-甲硫基丙醇、3,9-二甲基癸烷、2-丙基-1-庚醇、10-甲基十九烷、9-己基十五烷。以這些物質(zhì)成分的保留時間及相對含量為特征，形成5種常見李斯特菌特有的氣味化學條碼具有潛在可能性。

2.4 樣品中主要成分及含量

在空白培養(yǎng)基中，揮發(fā)性成分中相對含量較高的10個化合物占所有化合物總含量的62.1%。分別是：氨基脲、乙酰肼、異戊醛、2,2,3,4-四甲基丁烷、二甲基二硫、2,3,3-三甲基戊烷、2,5-二甲基吡嗪、2-乙基吡嗪、苯甲醛、3-乙基-2,5-甲基吡嗪。

英諾克李斯特菌揮發(fā)性成分中相對含量較高的10個化合物占所有化合物總含量的55.88%。分別是：氨基脲、異丁醛、異戊醛、2-甲基丁醛、二甲基二硫、2,5-二甲基吡嗪、苯甲醛、乙醇、丙酮、3-羥基-2-丁酮。

威爾士李斯特菌揮發(fā)性成分中相對含量較高的8個化合物占所有化合物總含量的44.97%。分別是：異戊醛、二甲基二硫、2,5-二甲基吡嗪、苯甲醛、3,8-二甲基癸烷、正二十烷、6-丁基壬烷、2,3,4-三甲基戊烷。

綿羊李斯特菌揮發(fā)性成分中相對含量較高的10個化合物占所有化合物總含量的71.17%。分別是：異戊醛、醋酸、2,5-二甲基吡嗪、苯甲醛、3-乙基-2,5-甲基吡嗪、甲硫醇、乙醇、乙酸異戊酯、奧肼、異戊醇。

格氏李斯特菌揮發(fā)性成分中相對含量較高的10個化合物占所有化合物總含量的73.72%。分別是：異丁醛、異戊醛、2,5-二甲基吡嗪、苯甲醛、乙醇、乙酸異戊酯、奧肼、異戊醇、2-甲基丁醇、氯氟乙酰胺。

單增李斯特菌揮發(fā)性成分中相對含量較高的9個化合物占所有化合物總含量的50.3%。分別是：異戊醛、2-甲基丁醛、2,5-二甲基吡嗪、苯甲醛、乙醇、丙酮、DL-丙氨酰-L-丙氨酸、甲酸異丁酯、二甲基二硫。

表4 5種李斯特屬菌揮發(fā)性代謝產(chǎn)物的化學組成Table 4 Chemical compositions of volatile compounds of five Listeria spp.

續(xù)表4

2.5 電子鼻檢測

通過電子鼻對樣品氣味的整體指紋信息進行統(tǒng)計學分析。電子鼻檢測原始數(shù)據(jù)的主成分分析結(jié)果見圖2。

圖 2 電子鼻檢測結(jié)果Fig.2 Results of electronic nose detection

從圖2可知，由于不同氣體樣本的物質(zhì)組成不同，從而得到傳感器不同的感應信號。通過儀器模式識別系統(tǒng)對樣品氣味的整體指紋信息進行統(tǒng)計學分析，電子鼻能夠較好的區(qū)分5種李斯特菌，同時也說明了5種菌的揮發(fā)性代謝產(chǎn)物存在一定差異。圖中5個平行能夠聚集在一起，表明電子鼻具有較好的重復性。各組樣品的整體氣味之間存在差異，由于差異程度不同，樣品之間又具有相似性。5種菌培養(yǎng)物的氣味都能夠與空白培養(yǎng)基(CK)的氣味區(qū)分開，英諾克李斯特菌、威爾士李斯特菌的氣味與綿羊李斯特菌的氣味相近，區(qū)別于格氏李斯特菌、單增李斯特菌的氣味。結(jié)果顯示基于電子鼻的氣味指紋技術(shù)能夠很好的將5種李斯特菌區(qū)分。

表5 電子鼻5次重復檢測值的相對標準偏差Table 5 Relative standard deviation from five replicates of electronic nose detection

通過分析各樣品5次重復、18根傳感器檢測值的相對標準偏差，見表5，RSD范圍在0.395%～3.634%，5種樣品的平均相對標準偏差分別為2.074%、1.400%、1.588%、2.571%、1.528%，表明傳感器有良好的檢測重復性。

2.6 樣品間氣味物質(zhì)聚類分析

以6個樣品的共有揮發(fā)性物質(zhì)和培養(yǎng)后5種菌新產(chǎn)生的共有揮發(fā)性物質(zhì)的種類以及相對含量做聚類分析，是利用樣品間歐氏距離的相似性對樣品空間進行分類，如圖3所示。

圖 3 樣品間的聚類圖Fig.3 Cluster analysis of five Listeria spp. and relative contents of new volatile comounds common to their metabolites

從兩部分圖中均可得5種菌培養(yǎng)后的揮發(fā)性代謝產(chǎn)物存在差異性。在對6組樣品的共有揮發(fā)性物質(zhì)的種類和相對含量進行比較中(圖3A)，綿羊李斯特菌與格氏李斯特菌的氣味相似；英諾克李斯特菌與單增李斯特菌的氣味相似；而威爾士李斯特菌的氣味明顯區(qū)別于其他菌。在對5種菌培養(yǎng)后新產(chǎn)生的共有的揮發(fā)性物質(zhì)的種類和相對含量進行比較中(圖3B)，綿羊李斯特菌與格氏李斯特菌的氣味相似，其次是英諾克李斯特菌和單增李斯特菌；同樣威爾士李斯特菌的氣味明顯區(qū)別于其他菌。從圖3顯示的歐式距離來看，根據(jù)共有揮發(fā)性物質(zhì)的種類和相對含量能夠更好的區(qū)分各個樣品，而它們所形成的化學條碼也更能體現(xiàn)各樣品的特征。

為了比較6個樣品間共有揮發(fā)性代謝產(chǎn)物的差異性，使用SPSS 17.0軟件對數(shù)據(jù)進行方差分析。分析結(jié)果中所有P值均小于0.05。如表6所示，在對每一種揮發(fā)性化合物的比較上，樣品間均有顯著差異。表明以共有揮發(fā)性代謝產(chǎn)物形成的化學條碼能夠很好的體現(xiàn)出樣品間的差異特征。說明此氣味指紋有望成為區(qū)分、鑒定5種李斯特菌的化學條碼。

表6 5種李斯特屬細菌共有揮發(fā)性代謝產(chǎn)物的相對含量Table 6 Contents of volatile compounds common to five Listeria spp.

3 討 論

本研究所用的李斯特菌目前分為6個種，即單核細胞增生李斯特菌、英諾克李斯特菌、西爾李斯特菌、威爾士李斯特菌、綿羊李斯特菌和格氏李斯特菌，其中只有單增李斯特菌和綿羊李斯特菌有致病性[19]。單增李斯特菌是人蓄共患病病原菌[20]，可以忍受較大范圍的pH值、溫度以及鹽脅迫，可在4℃繁殖生長[21]。因此，加強食源性單增李斯特菌的檢測及監(jiān)測，勢在必行。

據(jù)報道，除少數(shù)李斯特菌病爆發(fā)的案例與4a和4c血清型有關(guān)，大約有98%的李斯特菌病病例是由含1/2a，1/2b和4b這3種血清型的單增李斯特菌引起的，因此它們是引起人類疾病的主要血清型[20]。本研究得到了血清型為4b的單增李斯特菌與其他李斯特菌共有的揮發(fā)性代謝化合物及相對含量；形成的化學條碼，有望用來做為單增李斯特菌鑒定的依據(jù)。且得到了其培養(yǎng)后特有的氣味指紋化合物，形成了特有的化學條碼(二甲基硫、3-甲基-2-(3-甲基-2-丁烯基)呋喃、3-甲硫基丙醇、3,9-二甲基癸烷、2-丙基-1-庚醇、10-甲基十九烷、9-己基十五烷)。還比較了樣品的主要揮發(fā)性代謝物質(zhì)種類與相對含量，完善了化學信息，可以為今后食源性致病微生物氣味指紋庫的建立提供數(shù)據(jù)支持。但是考慮到應用氣味指紋技術(shù)進行鑒定、檢測是一項正在探索中的研究，想要其具有實際的應用價值需要考慮到氣味指紋的穩(wěn)定性、重復性等。研究中得到主要信息來源于化學統(tǒng)計分析，并沒有深入到分子層面。對擁有相同致病血清型的菌株之間的化學信息進行研究更具有意義。所以，在接下來的工作中將討論氣味指紋的穩(wěn)定性與重復性，并對擁有相同病血清型的菌株進行指紋分析。

[1] Ministry of Health of The People’s Republic of China. Ministry of Health brief on the national food poisoning in 2010[EB/OL]. (2011-03-02)[2012-02-26]. http： //www. moh. gov. cn/publicfiles/business/htmLfi les/mohwsyjbgs/s8354/201103/50797. htmL.

[2] ANTHONY P F, TUMER N M. Electronic nose and disease diagnostics[J]. Nature Reviews, 2004, 2(2)： 161-166.

[3] JOHAN S, JOHAN O, THOMAS B. Fungal volatiles as indicators of food and feeds spoilage[J]. Fungal Genetics and Biology, 1999, 27(2/3)： 209-217.

[4] GALLOSIS A, GRIMONT P D. Pyrazines responsible for the potatolike odor produced by some serratia and cedecea strains[J]. Pyrazines Applied and Environmental Microbiology, 1985, 50(4)： 1048-1051.

[5] SIRIPATRAWAN U, LINZ J E, HARTE B R. Neural network and electronic sensor array for determination of E. coli and volatile metabolites in nutrient media[J]. Analytica Chimica Acta, 2007, 581(1)： 63-70.

[6] BALASUBRAMANIANn S, PANIGRAHI S, LOHUE C M, et al. Identification of Salmonella-inoculated beef using a portable electronic nose system[J]. Journal of Rapid Methods and Automation in Microbiology, 2005, 13(2)： 71-95.

[7] SIRIPATRAWAN U. Self-organizing algorithm for classification of packaged fresh vegetable potentially contaminated with foodborne pathogens[J]. Sensors and Actuators B, 2008, 128(2)： 435-441 .

[8] BORJESSON T, STOLLMAN U, SCHNURER J. Volatile metabolites produced by six fungal species compared with other indicators of fungal growth on cereal grains[J]. Applied and Environmental Microbiology, 1992, 58(8)： 2599-2605.

[9] SCHNURER J, OLSSON J, BORJESSON T. Fungal volatiles as indicators of food and feeds spoilage[J]. Fungal Genetics and Biology, 1999, 27(2/3)： 209-217.

[10] SUNESSON A L, VAES W H J, NILSSON C A. Identification of volatile metabolites from five fungal species cultivated on two media[J]. Applied and Environmental Microbiology, 1995, 61(8)： 2911-2918.

[11] 樂長高, 謝宗波, 姜國芳, 等. 分析氧化硫硫桿菌培養(yǎng)液的揮發(fā)性成份[J]. 化學通報, 2004, 67(9)： 1-3.

[12] 楊康, 岳田利, 袁亞宏, 等. 利用頂空SPME-GC-MS聯(lián)用技術(shù)檢測蘋果汁中嗜酸耐熱菌代謝產(chǎn)物的研究[J]. 農(nóng)產(chǎn)品加工： 學刊, 2007, 94(3)： 8-10.

[13] 呂均, 秦巧玲, 郭愛玲, 等. GC-MS 技術(shù)在鑒定食源性致病菌研究中的應用[J]. 食品科學, 2008, 29(2)： 355-358.

[14] 陳列忠, 申屠旭萍, 陳建明, 等. 氣相色譜/質(zhì)譜法測定哈茨木霉菌代謝產(chǎn)物中單端孢霉烯化合物的含量[J]. 分析化學, 2007, 35(9)： 1362-1364.

[15] 喻勇新, 劉源, 趙勇, 等. 基于電子鼻區(qū)分三種致病菌的研究[J]. 傳感技術(shù)學報, 2010, 23(1)： 10-13.

[16] 喻勇新, 孫曉紅, 趙勇, 等. 應用電子鼻檢測食源性致病菌的研究[J]. 化學通報, 2010, 70(2)： 154 -159.

[17] 胡惠平, 劉源, 趙勇, 等. 應用電子鼻技術(shù)檢測南美白對蝦副溶血性弧菌試驗[J]. 漁業(yè)現(xiàn)代化, 2009, 36(3)： 41-48.

[18] 胡惠平, 潘迎捷, 趙勇, 等. 應用氣味指紋技術(shù)檢測豬肉假單胞菌[J]. 食品科學, 2009, 30(18)： 327-332.

[19] HAIN T, STEINWG C, CHAKRABORTY T. Comparative and functional genomics of Listeria spp[J]. Journal of Biotechnology, 2006, 126(1)： 37-51.

[20] LOW J C , DONACHIE W. A review of Listeria monocytogenes and listeriosis[J]. Veterinary Journal, 1997, 153(1)： 9-29.

[21] CHAN Y C, WIEDMANN M. Physiology and genetics of Listeria monocytogenes survival and growth at cold temperatures[J]. Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 2009, 49(3)： 237-253.