高效液相色譜法測(cè)定雞肉中磺胺類藥物殘留的不確定度評(píng)定

趙健亞，陳 丹，謝懷根，肖 靜,*

(1.南通大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，江蘇 南通 226019；2.南通市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，江蘇 南通 226006)

一切測(cè)量結(jié)果都不可避免地具有不確定度，測(cè)量不確定度是表征賦予被測(cè)量量值分散性的非負(fù)參數(shù)[1-2]，它可以定量表示測(cè)量結(jié)果的質(zhì)量，只有附上不確定度說(shuō)明才能實(shí)現(xiàn)檢測(cè)結(jié)果的完整表達(dá)[3-4]?；前奉愃幬飳?gòu)V譜抗菌藥，價(jià)格低廉，是治療畜禽感染的常用獸藥[5]。由于其在動(dòng)物體內(nèi)作用時(shí)間和代謝時(shí)間較長(zhǎng)，易造成可食組織殘留，給人類健康帶來(lái)危害[6]。各國(guó)對(duì)動(dòng)物性食品中磺胺類藥物殘留嚴(yán)格規(guī)定了限量標(biāo)準(zhǔn)，歐盟規(guī)定總殘留不應(yīng)超過(guò)0.1mg/kg[7]。本實(shí)驗(yàn)依據(jù)JJF 1059—1999《測(cè)量不確定度評(píng)定與表示》[1]和CNAS—GL06《化學(xué)分析中不確定度的評(píng)估指南》[8]規(guī)定的基本方法和程序，對(duì)高效液相色譜法測(cè)定雞肉中磺胺類藥物殘留的不確定度進(jìn)行分析評(píng)定，找出主要分量，在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中重點(diǎn)控制從而提高檢測(cè)質(zhì)量。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

樣品為市區(qū)農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)隨機(jī)抽查的雞肉。

5種磺胺標(biāo)準(zhǔn)品：磺胺間甲氧嘧啶(SMM)、磺胺二甲基嘧啶(SM2)、磺胺甲惡唑(SMZ)和磺胺二甲氧嘧啶(SDM)(純度均為99%)，磺胺喹惡啉(SQ)(純度為97.2%) 美國(guó)Sigma公司；乙腈(色譜純) 德國(guó)Meker公司；其余試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

1100高效液相色譜系統(tǒng)(配紫外檢測(cè)器和自動(dòng)進(jìn)樣器) 美國(guó)Agilent公司；3K15臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) 德國(guó)Sigma公司；AB265-S分析天平 瑞士Mettler公司；AB204-N分析天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；R-215旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 瑞士Büchi公司；Bond-Elut-Al-B固相萃取柱(500mg/3mL) 美國(guó)Varian公司。

1.3 樣品前處理方法

參考NY502—2001《磺胺類藥物在動(dòng)物可食性組織中殘留的高效液相色譜檢測(cè)方法》[9]進(jìn)行。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

1.4.1 單標(biāo)儲(chǔ)備液的配制分別準(zhǔn)確稱取5種磺胺標(biāo)準(zhǔn)品50mg于50mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，質(zhì)量濃度為1mg/mL。

1.4.2 混合標(biāo)準(zhǔn)中間液的配制

分別準(zhǔn)確吸取以上5種單標(biāo)儲(chǔ)備液各1mL置100mL容量瓶中，用流動(dòng)相稀釋并定容，得到質(zhì)量濃度10μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)中間液。

1.4.3 混合標(biāo)準(zhǔn)工作液的配制

按表1配制方法用流動(dòng)相將混合標(biāo)準(zhǔn)中間液逐級(jí)稀釋成質(zhì)量濃度為1.0、0.5、0.2、0.1、0.05μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。

表1 標(biāo)準(zhǔn)工作液的配制Table 1 Preparation of standard working solution

1.5 色譜條件

色譜柱：C18柱(250mm×4.6mm，5μm)；流動(dòng)相：乙腈-甲醇-水-乙酸(2：2：9：0.2，V/V)；流速：1.0mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：270nm；柱溫：室溫；進(jìn)樣量20μL。

2 結(jié)果與分析

2.1 數(shù)學(xué)模型

式中：W為樣品中磺胺類藥物含量/(mg/kg)；C0為定容液中磺胺類藥物質(zhì)量濃度/(μg/mL)；VX為樣液定容體積/mL；m為樣品質(zhì)量/g；fr為回收率校正因子。

2.2 不確定度的來(lái)源分析

從實(shí)際測(cè)量過(guò)程和數(shù)學(xué)模型分析，磺胺類藥物殘留測(cè)定的不確定度主要來(lái)源于標(biāo)準(zhǔn)溶液配制、標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合、樣品前處理、測(cè)量重復(fù)性等[10]。

2.3 不確定度分量的評(píng)定

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制引入的不確定度

2.3.1.1 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)純度引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(p)

標(biāo)準(zhǔn)品證書給出SMM、SM2、SMZ和SDM的擴(kuò)展不確定度為0.5%，包含因子k＝2，4種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)不確定度均為u(p)1=0.5%/2=2.500×10-3，則urel(p)1=2.500×10-3/ 99%=2.525×10-3；證書給出SQ的擴(kuò)展不確定度為1%，包含因子k＝2，其標(biāo)準(zhǔn)不確定度為u(p)2=1%/2=5.000×10-3，則urel(p)2=5.000×10-3/97.2%=5.144×10-3。

2.3.1.2 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)稱量引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(m)

2.3.1.3 標(biāo)準(zhǔn)工作液配制過(guò)程引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(V)1)量器校準(zhǔn)引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(V)1

表2 量器校準(zhǔn)引入的不確定度Table 2 Uncertainties caused by glass container calibration

表3 環(huán)境溫度變化引入的不確定度Table 3 Uncertainties caused by environmental temperature change

2.3.1.4 合成標(biāo)準(zhǔn)溶液配制的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(std)

2.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(C0)

表4 5種磺胺類藥物的標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定結(jié)果和不確定度計(jì)算Table 4 Standard curves of five sulfonamides and uncertainties

2.3.3 樣品前處理引入的不確定度

2.3.3.1 樣品稱量引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(m’)

2.3.3.2 試樣定容體積引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(VX)

表5 5種磺胺類藥物的加標(biāo)回收率測(cè)定結(jié)果和不確定度計(jì)算Table 5 Recoveries of five sulfonamides at different spike levels and uncertainties

2.3.4 樣品重復(fù)測(cè)定引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(Wrep)

表6 重復(fù)測(cè)定結(jié)果和不確定度計(jì)算Table 6 Results of repeatability and uncertainties

2.4 合成不確定度及檢測(cè)結(jié)果表述

表7 不確定度評(píng)定結(jié)果Table 7 Uncertainty evaluation for the determination of five sulfonamides

3 結(jié) 論

通過(guò)對(duì)高效液相色譜法測(cè)定雞肉中磺胺類藥物殘留的不確定度各分量的評(píng)定，可見(jiàn)最終結(jié)果的不確定度主要由標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合、樣品前處理過(guò)程和測(cè)量重復(fù)性引起，其次為標(biāo)準(zhǔn)溶液配制過(guò)程。實(shí)際操作過(guò)程中可通過(guò)增加混合標(biāo)準(zhǔn)系列工作液測(cè)定次數(shù)、優(yōu)化樣品前處理方法、增加平行樣測(cè)定及選擇精度較高玻璃量器來(lái)減小引入的不確定度，從而提高檢測(cè)質(zhì)量。

[1] 國(guó)家質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局. JJF 1059—1999測(cè)量不確定度評(píng)定與表示[S]. 北京： 中國(guó)計(jì)量出版社, 1999.

[2] JCGM 200： 2008, International vocabulary of basic and general terms in metrology(VIM). 3rd edition[S]. BIPM and ISO, 2008.

[3] 國(guó)家質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局計(jì)量司. 測(cè)量不確定度評(píng)定與表示指南[S]. 北京： 中國(guó)計(jì)量出版社, 2000.

[4] ISO-ISBN 92-67-10188-9 Guide to the expression of uncertainty in measurement[S]. Geneva, 1995.

[5] 沈建忠, 謝聯(lián)金. 獸醫(yī)藥理學(xué)[M]. 北京： 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社, 2000： 155.

[6] 李俊鎖, 邱月明, 王超, 等. 獸藥殘留分析[M]. 上海： 上?？茖W(xué)技術(shù)出版社, 2002： 232.

[7] The Commission of the European Communities. Council Regulation (EEC) No 2377/90 laying down a Community procedure for the establishment of maximum residue limits of veterinary medicinal products in foodstuffs of animal origin[J]. Off J Eur Commun, 1990, 62(2)： 16-17.

[8] 中國(guó)合格評(píng)定國(guó)家認(rèn)可委員會(huì). CNAS—GL06 化學(xué)分析中不確定度的評(píng)估指南[S]. 北京： 中國(guó)計(jì)量出版社, 2006.

[9] 中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部. NY 5029—2001 無(wú)公害食品豬肉附錄E磺胺類藥物在動(dòng)物可食性組織中殘留的高效液相色譜檢測(cè)方法[S].

[10] 國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局. JJF 1135—2005 化學(xué)分析測(cè)量不確定度評(píng)定[S]. 北京： 中國(guó)計(jì)量出版社, 2005.

[11] 國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局. JJG 196—2006 常用玻璃量器檢定規(guī)程[S]. 北京： 中國(guó)計(jì)量出版社, 2006.