酪蛋白糖巨肽和乳鐵蛋白灌胃對小鼠腸道微生物定殖抗力的影響

任效東，陳慶森*，李俊潔，周麗麗，閻亞麗

(天津市食品生物技術(shù)重點實驗室，天津商業(yè)大學(xué)生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院，天津 300134)

酪蛋白糖巨肽(casein glycomacropeptide，CGMP)是一種糖基磷酸肽，其主要是在生產(chǎn)干酪的過程中，由κ-酪蛋白經(jīng)凝乳酶(rennet enzyme)降解后產(chǎn)生的一類含糖鏈的多肽片段[1]。在1965年Delfour等[2]利用凝乳酶作用κ-酪蛋白的特定部位，發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生副κ-酪蛋白和可溶于12%三氯乙酸(TCA)水溶液的多肽片段，該多肽部分含有豐富的糖鏈基團(tuán)，因而被稱為糖巨肽，由于來自酪蛋白所以統(tǒng)稱為CGMP。近年來國內(nèi)外的學(xué)者大量研究和報道了CGMP的生物學(xué)活性，其中包括：結(jié)合霍亂毒素和大腸桿菌腸毒素[3-4]；抑制細(xì)菌和病毒吸附[5]；促進(jìn)雙歧桿菌增殖[6]；調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)應(yīng)答[7]；抑制胃酸分泌[8]等。同時CGMP不含有芳香族氨基酸，所以可作為苯丙酮尿癥(PKU)患者的專用蛋白質(zhì)的來源[9]。

乳鐵蛋白(lactoferrin，Lf)是一種分子質(zhì)量約為80kD的鐵結(jié)合性糖蛋白，主要存在于哺乳動物的各種外分泌物中[10]。1960年首先由Groves從牛乳中分離獲得，因與鐵結(jié)合呈紅色故稱之為“紅蛋白”[11]。由于Lf兼具抗菌和多種生物學(xué)功能，既可用作食品和化妝品的天然防腐劑，也可以直接作為功能性食品、保健品或藥品來防治感染性疾病，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)療領(lǐng)域[12-13]。

腸道微生物定殖抗力(colonization resistance，CR)是于1971年由荷蘭的微生物學(xué)家van der Waaij等[14]提出的，腸道內(nèi)源性專性厭氧菌具有抑制消化道內(nèi)主要需氧菌的潛在的致病菌群數(shù)量的作用。Vollaard等[15]認(rèn)為在糞便內(nèi)需氧革蘭氏陰性桿菌、酵母菌和腸球菌的數(shù)量可以作為腸道微生物定殖抗力的指標(biāo)。腸道菌群間形成的相互協(xié)調(diào)、制約的微生態(tài)環(huán)境與人體健康密切相關(guān)。近年來隨著厭氧菌培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展，對腸道厭氧菌的作用尤其是雙歧桿菌具有的作用有了比較透徹的了解。通過用雙歧桿菌數(shù)量與腸桿菌數(shù)量的對數(shù)值比值(B/E值)來作為CR的指標(biāo)，使其具有很重要的臨床意義。由于B/E值包括了腸道內(nèi)組成定殖抗力主要的有益專性厭氧菌——雙歧桿菌與主要需氧條件下的致病菌——腸桿菌這兩部分，所以其能更加全面、簡潔地反映出腸道內(nèi)的定殖抗力的概況。同時B/E值的確定可能也便于指導(dǎo)臨床應(yīng)用微生態(tài)活菌制劑[16]。

本研究從腸道微生物定殖抗力的定義出發(fā)，以正常小鼠作為研究對象，用乳源CGMP和Lf進(jìn)行干預(yù)，通過對小鼠腸道糞便中雙歧桿菌和腸桿菌定性、定量檢測，探討糞便中雙歧桿菌和腸桿菌的數(shù)量的變化，以B/E值作為腸道微生物定殖抗力的指標(biāo)，闡明2種乳源生物活性肽在促進(jìn)動物腸黏膜對有益菌的定殖力水平，以及維系腸道微生物菌群健康的作用，也為乳源生物活性肽廣泛應(yīng)用于腸道健康提供科學(xué)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

BALB/c雄性健康小鼠(SPF級，8周齡，體質(zhì)量(25±2)g)、小鼠常規(guī)飼料，購自中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心。

1.2 試劑與儀器

L-鹽酸半胱氨酸、X-Gal 拜爾迪生物技術(shù)有限公司；乳鐵蛋白和CGMP 新西蘭Tatua公司；瓊脂粉 北京奧博星生物科技有限責(zé)任公司；伊紅美藍(lán)瓊脂(EMB)和改良的MRS培養(yǎng)基 青島高科園海博生物技術(shù)有限公司。

MLS-3750三洋全自動滅菌鍋 日本三洋公司；SPX-250BS-II生化培養(yǎng)箱 上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；FA2004A電子分析天平 上海滬西分析儀器有限公司；XW-80A微型旋渦混合儀 上海滬西分析儀器有限公司；可調(diào)節(jié)移液器及吸頭 德國普蘭德(Brand)公司。

1.3 CGMP溶液和Lf溶液的配制

1.3.1 CGMP溶液

準(zhǔn)確稱取0.063g的CGMP置于10mL的離心管中，加入無菌的生理鹽水6mL，充分混勻，作為CGMP的母液備用(質(zhì)量濃度為10.5mg/mL)，用CGMP的母液配成質(zhì)量濃度分別為0.3、0.5、0.7mg/mL的溶液，每天用前新鮮配制。

1.3.2 Lf溶液

準(zhǔn)確稱取0.05g 的乳鐵蛋白置于10mL的離心管中，加入無菌的生理鹽水5mL，充分混勻，作為乳鐵蛋白的母液備用(質(zhì)量濃度為10mg/mL)，用Lf的母液配成質(zhì)量濃度分別為0.01、0.1、1mg/mL的溶液，每天用前新鮮配制。

1.4 方法

1.4.1 分組和給藥

實驗小鼠購得后適應(yīng)飼養(yǎng)一周之后隨機(jī)分為8組，每組6只，各組喂以基礎(chǔ)飼料；實驗期間，每天給小鼠灌胃，各組小鼠均自由取食和飲水，灌胃的周期為14d。組別、實驗項目及灌胃劑量見表1。

表1 組別、實驗項目及灌胃劑量Table 1 Mouse groups and corresponding administration doses

1.4.2 糞便樣品的處理

“重要的是，這些巨噬細(xì)胞會發(fā)生和許多吸煙者及慢性阻塞性肺疾病患者中的巨噬細(xì)胞相似的病理變化。”這項研究的主要研究人員指出，肺泡巨噬細(xì)胞屬于免疫細(xì)胞，能夠吞噬和清除灰塵、細(xì)菌和過敏源，電子煙蒸汽會損害這些功能。因此，電子煙的危害或許比過去認(rèn)為的更大。

分別于第0(即灌胃前1d)、3、7、11、15、21天(即停止灌胃后第6天)用逼迫法在無菌條件下分別采集8組小鼠的新鮮糞便，每組糞便樣品放入2支已滅菌的小試管中，每管約0.1g糞便，稱質(zhì)量，分別置于10mL滅菌的生理鹽水中，然后將試管置于XW-80A微型旋渦混合儀上進(jìn)行充分振蕩混勻，再用無菌生理鹽水將8組糞便懸液依次進(jìn)行10倍稀釋至10-5稀釋度。

1.4.3 腸道B/E值的檢測和分析

1.4.3.1 雙歧桿菌的培養(yǎng)及計數(shù)

利用傳統(tǒng)菌群鑒定的方法，選擇10-3、10-4、10-5稀釋度的樣品0.5mL采用傾注平板法在改良的MRS培養(yǎng)基上于37℃條件下進(jìn)行厭氧培養(yǎng)，每個稀釋度做3個平行板，于(72±3)h后進(jìn)行觀察以及菌落計數(shù)，結(jié)果以每克糞便中的細(xì)菌菌落數(shù)的對數(shù)值表示。

1.4.3.2 腸桿菌的培養(yǎng)及計數(shù)

利用傳統(tǒng)菌群鑒定的方法，選擇10-2、10-3、10-4稀釋度的樣品0.5mL采用傾注平板法在伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基上于37℃進(jìn)行培養(yǎng)，每個稀釋度做3個平行板，于(48±3)h后進(jìn)行觀察以及菌落計數(shù)，結(jié)果以每克糞便中的細(xì)菌菌落數(shù)的對數(shù)值表示。

1.4.3.3 B/E值的檢測[16]

1.4.4 統(tǒng)計方法

2 結(jié)果與分析

2.1 CGMP對BALB/c小鼠腸道雙歧桿菌的影響

圖 1 CGMP對小鼠腸道雙歧桿菌的影響Fig.1 Effect of CGMP on intestinal Bifi dobacterium numbers of mice in different groups

以正常小鼠為實驗對象，由圖1可知，對照組和安慰組腸道內(nèi)雙歧桿菌的水平?jīng)]有明顯的變化，兩種干預(yù)條件下，生理波動范圍是4.22×108～1.05×109CFU/g。低劑量CGMP組和高劑量CGMP組的波動趨勢與對照組、安慰組基本一致，在2.61×108～1.78×109CFU/g之間波動，通過SPSS11.5統(tǒng)計軟件進(jìn)行顯著性檢驗，不存在顯著性差異(P＞0.05)，即對小鼠腸道雙歧桿菌的增殖作用不顯著。從高劑量的CGMP組第0～3天的結(jié)果可以看出，雙歧桿菌的數(shù)量有顯著的增長，說明高劑量(即CGMP質(zhì)量濃度達(dá)到0.14mg/mL)CGMP可以有效地促進(jìn)雙歧桿菌的增殖，但隨后促進(jìn)效果并不明顯，分析表明高劑量連續(xù)干預(yù)小鼠腸黏膜發(fā)生耐受，導(dǎo)致雙歧桿菌數(shù)量的明顯下降；隨后腸道干預(yù)適應(yīng)性增強(qiáng)，雙歧桿菌菌數(shù)不斷升高；到干預(yù)結(jié)束菌數(shù)明顯下降。中劑量的CGMP組與對照組、安慰組相比，其雙歧桿菌的水平在3.00×108～3.44×109CFU/g之間波動，存在顯著性差異(P＜0.05)。中劑量組在干預(yù)的第3天后雙歧桿菌的數(shù)量就發(fā)生了很大的變化，并處于直線上升的趨勢，在第11天達(dá)到最高值(3.44×109CFU/g)。但當(dāng)?shù)?5天停止灌胃后，雙歧桿菌的數(shù)量雖然有所回落，但在6d后的檢測小鼠糞便雙歧桿菌的數(shù)量水平仍高于灌胃前1個數(shù)量級。該研究結(jié)果提示，給實驗動物以灌胃方式干預(yù)小鼠腸道雙歧桿菌增殖，非常顯著地存在小分子短肽劑量與增殖效果的相關(guān)性。

2.2 乳鐵蛋白對BALB/c小鼠腸道雙歧桿菌的影響

圖 2 乳鐵蛋白對小鼠腸道雙歧桿菌的影響Fig.2 Effect of Lf on intestinal Bifi dobacterium numbers of mice in different groups

由圖2可知，對于正常小鼠其對照組、安慰組和低乳鐵蛋白組腸道內(nèi)雙歧桿菌的菌數(shù)的影響水平基本上一致，表明低劑量的干預(yù)對腸道內(nèi)雙歧桿菌沒有促進(jìn)增殖的作用，統(tǒng)計分析表明不存在顯著性差異(P＞0.05)，其波動范圍為4.22×108～1.16×109CFU/g。高劑量的乳鐵蛋白組在第0～3天取樣的檢測結(jié)果可以看出，雙歧桿菌的數(shù)量有顯著的增長且達(dá)到最高值(5.40×109CFU/g)，但從第7天以后的分析結(jié)果來看，腸道中雙歧桿菌的數(shù)量回落到對照組和安慰劑組的水平，說明剛開始(1～3d)灌胃大劑量的乳鐵蛋白可以有效地促進(jìn)雙歧桿菌的增殖作用；隨著干預(yù)時間的延長，小鼠腸道內(nèi)雙歧桿菌的菌數(shù)水平降低，可能是因為腸道黏膜中的雙歧桿菌對乳鐵蛋白刺激存在明顯的耐受性。中劑量的乳鐵蛋白組與對照組、安慰組相比，其增殖腸內(nèi)雙歧桿菌的菌數(shù)水平在4.84×108～2.29×109CFU/g水平，存在顯著性差異(P＜0.05)。中劑量組在連續(xù)灌胃到11d(即1～11d的連續(xù)干預(yù)條件下)雙歧桿菌的數(shù)量表現(xiàn)上升趨勢，在第11天達(dá)到2.29×109CFU/g水平。但從11d以后的連續(xù)干預(yù)，使腸道內(nèi)雙歧桿菌的菌數(shù)逐漸下降，表明一定劑量的乳鐵蛋白的長時間連續(xù)干預(yù)對腸道內(nèi)有益菌的增殖將發(fā)生負(fù)相關(guān)作用，也提示乳鐵蛋白的劑量越高腸內(nèi)雙歧桿菌的耐受時間越短。當(dāng)?shù)?5天停止灌胃后，連續(xù)干預(yù)的影響使腸道內(nèi)雙歧桿菌的數(shù)量明顯地回落到對照組的水平。

2.3 CGMP對BALB/c小鼠腸道腸桿菌的影響

由圖3可知，對照組和安慰組腸道內(nèi)腸桿菌的數(shù)量沒有明顯的變化，在8.87×106～1.99×107CFU/g之間較窄的范圍內(nèi)變化。低劑量組對腸道腸桿菌影響的變化趨勢與對照組和安慰組相比存在相似的趨勢，不存在顯著性差異(P＞0.05)，其波動范圍在1.13×107～2.72×107CFU/g之間，說明低劑量的CGMP對腸道內(nèi)腸桿菌數(shù)量的影響存在微弱的促進(jìn)作用。中劑量CGMP組從第3、7天的取樣分析結(jié)果看，顯示較為明顯的促進(jìn)腸內(nèi)腸桿菌的增殖作用；從實驗的第7天開始腸道腸桿菌的數(shù)量明顯減少且下降的幅度很大，連續(xù)灌胃的第7～21天的波動范圍為3.14×107～5.14×106CFU/g，存在顯著性差異(P＜0.05)，說明灌胃合適劑量的CGMP可以有效地抑制腸桿菌的增殖，降低了條件致病菌的致病幾率。相比之下，灌胃高劑量的CGMP則在一定程度上起到了促進(jìn)腸道腸桿菌增殖的作用，其波動范圍8.41×106～3.66×107CFU/g。

圖 3 CGMP對小鼠腸道腸桿菌的影響Fig.3 Effect of CGMP on intestinal Enterobacter numbers of mice in different groups

2.4 乳鐵蛋白對BALB/c小鼠腸道腸桿菌的影響

圖 4 乳鐵蛋白對小鼠腸道腸桿菌的影響Fig.4 Effect of Lf on intestinal Enterobacter numbers of mice in different groups

由圖4可知，低劑量的乳鐵蛋白組腸道內(nèi)腸桿菌的數(shù)量上下緩慢波動(1.24×107～2.29×107CFU/g)，其變化趨勢與對照組和安慰組相比基本一致，沒有明顯變化，統(tǒng)計分析表明，低劑量的乳鐵蛋白對腸桿菌的影響不存在顯著性差異(P＞0.05)。中劑量組在干預(yù)的前7d腸道內(nèi)腸桿菌的水平變化趨勢與對照組、安慰組基本一致，但從實驗的第7天開始腸道腸桿菌的數(shù)量明顯減少且下降的幅度較大，存在顯著性差異(P＜0.05)，其波動范圍在8.50×106～2.33×107CFU/g之間，說明灌胃合適劑量的乳鐵蛋白可以有效地抑制腸桿菌的增殖，降低了條件致病菌的致病幾率。相比之下，連續(xù)灌胃高劑量的乳鐵蛋白15d，腸道內(nèi)腸桿菌的數(shù)量緩慢波動呈上升趨勢，在停止灌胃后腸道內(nèi)腸桿菌的數(shù)量雖然有所下降，但其仍然高于灌胃前腸桿菌的數(shù)量，說明高劑量的乳鐵蛋白在一定程度上促進(jìn)了小鼠腸道腸桿菌的增殖。

2.5 CGMP和乳鐵蛋白對BALB/c小鼠腸道B/E值的影響

圖 5 CGMP和乳鐵蛋白對小鼠腸道B/E值的影響Fig.5 Effect of CGMP and Lf on intestinal B/E ratio of mice in different groups

由圖5可知，安慰組對小鼠腸道B/E值的波動趨勢與對照組基本一致，均為緩慢的上下波動，其波動范圍在1.22～1.27之間。低劑量CGMP組和低劑量乳鐵蛋白組與對照組、安慰組相比B/E值的波動趨勢沒有大的變化，不存在顯著性差異(P＞0.05)，說明灌胃低劑量的CGMP和乳鐵蛋白對小鼠腸道B/E值沒有明顯的影響。

高劑量CGMP組B/E值在第3天時達(dá)到最高值1.3，隨后在第7天下降到最低值1.17，后有緩慢的回升，說明剛開始(1～3d)灌胃大劑量的CGMP可有效地促進(jìn)雙歧桿菌的增殖，對腸桿菌的作用并不明顯，在第7天時雙歧桿菌的數(shù)量明顯下降，相對的腸桿菌的數(shù)量是上升的，隨后兩種菌群的數(shù)量均呈上下波動。高劑量乳鐵蛋白組B/E值也是在干預(yù)的第3天達(dá)到最高值1.35，隨后一段時間內(nèi)(3～15d)B/E值呈直線下降趨勢，在第15天達(dá)到最低值1.14，停止灌胃6d后有所回升，說明在干預(yù)開始時連續(xù)灌胃高劑量的乳鐵蛋白3d，可以有效地促進(jìn)雙歧桿菌的增殖，對腸桿菌的作用效果不明顯，但隨后雙歧桿菌的增殖受到抑制，相反的，腸桿菌的增殖受到了促進(jìn)，停止灌胃6d后取樣分析表明腸桿菌的數(shù)量有所下降。

中劑量的CGMP和乳鐵蛋白組在實驗的前期B/E值的變化趨勢與對照組、安慰組基本一致，沒有較大的波動，但在第7天開始有上升的趨勢，存在顯著性差異(P＜0.05)，且在停止灌胃后6d均有所回落。中劑量乳鐵蛋白組B/E值的波動范圍為1.23～1.30，在第7天達(dá)到最低值(1.23)后開始上升，在第15天達(dá)到最高值(1.3)后開始回落。在干預(yù)的前7d兩種菌群均為上升趨勢，在第7天腸桿菌上升到最高值后開始回落，而雙歧桿菌在第7天后繼續(xù)上升到干預(yù)的第11天達(dá)到最高值后開始回落，在第11～15天腸桿菌的下降速率比雙歧桿菌的下降速率快，因而B/E值呈上升趨勢；但停止灌胃6d后雙歧桿菌的下降速率比腸桿菌的快，B/E值呈下降趨勢。中劑量CGMP組B/E值的波動范圍在1.20～1.41之間，在第0天到干預(yù)的第7天B/E值的波動趨勢不明顯，但在隨后的一段時間內(nèi)(7～15d)呈直線上升趨勢，在干預(yù)的第15天達(dá)到最高值1.41后開始回落。在CGMP干預(yù)的第3～11天雙歧桿菌呈直線上升達(dá)到最高值，隨后到第15天有緩慢的回落趨勢，而腸桿菌是在第7～15天呈直線下降，因而B/E值在第7～15天呈直線上升，而在第3～7天兩種菌群均為上升，但雙歧桿菌的上升速率較快，因而B/E值呈緩慢上升。停止灌胃6d后，雙歧桿菌的數(shù)量下降趨勢比腸桿菌的顯著，則B/E值有所回落。通過以上分析表明，中劑量的CGMP對小鼠腸道B/E值的促進(jìn)作用比中劑量的乳鐵蛋白的促進(jìn)作用更為顯著。

從以上腸道微生物定殖抗力指標(biāo)(B/E值)的分析表明，低劑量的CGMP和乳鐵蛋白對小鼠腸道B/E值的影響不顯著，中劑量的CGMP和乳鐵蛋白均可使B/E值增加，但中劑量的CGMP對小鼠腸道B/E值的促進(jìn)作用比中劑量的乳鐵蛋白的促進(jìn)作用更為顯著。高劑量的CGMP和乳鐵蛋白在實驗前期(1～3d)均可使B/E值增加，隨后高劑量的CGMP對B/E值的影響不大，而高劑量的乳鐵蛋白則使B/E值上下波動明顯。

3 結(jié)論與討論

盡管有關(guān)CGMP和乳鐵蛋白促進(jìn)和調(diào)控腸道雙歧桿菌和腸桿菌變化規(guī)律的研究報道很少，但已有研究表明，胃腸道正常的雙歧桿菌和腸桿菌的菌群參與了生物體的生理、生化、病理和藥理的全過程，這些正常的菌群實際上已成為宿主生命必需的組成部分，而這也會對生命奧秘的揭示做出重大的貢獻(xiàn)[17-19]。本研究利用CGMP和乳鐵蛋白對小鼠腸道B/E值的影響進(jìn)行了系統(tǒng)的研究，得到了如下的研究結(jié)果：1)利用傳統(tǒng)菌群鑒定的方法，研究證實了CGMP和乳鐵蛋白的最佳口服劑量分別為0.5mg/mL和0.1mg/mL作為腸道中有益菌的增殖底物。且灌胃中劑量的CGMP對小鼠腸道B/E值的影響最為顯著，B/E值顯著增加，特別是明顯地促進(jìn)雙歧桿菌增殖，且抑制腸桿菌增殖。2)本研究證實了腸道B/E值具有作為腸道微生物定殖抗力指標(biāo)。在國內(nèi)外的研究中曾提出B/E值可作為腸道定殖抗力的指標(biāo)，并且認(rèn)為B/E值小于1表示腸道定殖抗力受損[14-16,20]。在本研究結(jié)果中顯示各組B/E值均大于1表示腸道定殖抗力正常。3)從2種乳源生物活性短肽對小鼠腸道內(nèi)雙歧桿菌和腸桿菌的影響研究表明，不同劑量的生物活性短肽對腸道內(nèi)不同菌屬的作用功效存在明顯的劑量依賴性關(guān)系。研究還提示，小鼠腸道內(nèi)不同微生物種屬尚表現(xiàn)對一定干預(yù)時間的適應(yīng)能力，說明生物活性物質(zhì)對動物腸道微生物的干預(yù)具有耐受性的特征。研究獲得的這些成果與本實驗室前期研究[21]的結(jié)論是一致的。

本研究結(jié)論對CGMP和乳鐵蛋白與機(jī)體腸道菌群關(guān)系的研究具有很好的應(yīng)用價值。根據(jù)糞便中B/E值的變化，評價正常小鼠腸道微生物定殖抗力，為CGMP和乳鐵蛋白的功能特性的廣泛應(yīng)用提供一定的理論依據(jù)。

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