蒜苗過氧化氫酶的分離純化及部分性質(zhì)研究

胡瑞斌，孫 芳，任美鳳，唐云明*

(西南大學生命科學學院，重慶市甘薯工程研究中心，三峽庫區(qū)生態(tài)環(huán)境教育部重點實驗室，重慶 400715)

過氧化氫酶(catalase，CAT)又稱觸酶，是一類普遍存在于動植物和絕大多數(shù)需氧微生物體內(nèi)的末端氧化酶。其生理功能是催化細胞內(nèi)過氧化氫分解，防止過氧化，清除生物體內(nèi)的活性氧[1]。與超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)共同組成了生物體內(nèi)活性氧防御系統(tǒng)[2]。它在食品加工、臨床醫(yī)療、紡織、印染、環(huán)保等行業(yè)具有十分重要的應用價值[3-9]。同時來源于植物的CAT市場上很少，而且植物材料含有相對較少的雜蛋白，因此研究開發(fā)取材簡便、價格低廉、活性較高而且性質(zhì)穩(wěn)定的植物CAT有著十分重要的意義。蒜苗，又叫蒜毫、青蒜，是大蒜幼苗發(fā)育到一定時期的青苗，是一種四季生長又廉價易得的綠色蔬菜。它含有豐富的VC以及可溶性蛋白質(zhì)、游離氨基酸、多糖、大蒜素等營養(yǎng)成分并能增進食欲，具有殺菌作用[10]。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，蒜苗中過氧化氫酶含量較一般植物中高，在實驗過程中較穩(wěn)定且從蒜苗中分離純化過氧化氫酶未見報道。本研究以新鮮的蒜苗為材料，從中分離純化CAT并對其部分性質(zhì)進行研究，以期為工業(yè)生產(chǎn)及進一步的開發(fā)應用該酶提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

以新鮮白皮蒜苗的葉片為提取過氧化氫酶的材料，購自重慶市北碚區(qū)菜市場。

DEAE-Sepharose、Superdex-200、凝膠過濾層析分子質(zhì)量標準品、蛋白質(zhì)SDS-PAGE標準品 美國GE Healthcare公司；三羥甲基氨基甲烷 香港Farco公司；丙烯酰胺、甲叉-雙丙烯酰胺 瑞士Fluka公司；考馬斯亮藍R-250 美國Bio-Rad公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Mill-Q plus超純水儀 美國Millipore公司；PHS-32W微電路pH計 上海理達儀器廠；精密電子天平 瑞士Mettler-Toledo公司；GL-21M高速冷凍離心機 湖南湘儀公司；UV-2550型分光光度計、蛋白核酸定量儀 日本島津公司；AKTA prime plus蛋白質(zhì)純化系統(tǒng) 美國GE公司；冷凍干燥儀 德國Uni Equip公司；垂直板電泳槽和電泳儀 美國Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 粗酶液的提取

新鮮蒜苗葉片，用去離子水沖洗干凈，擦干，稱質(zhì)量后剪碎，然后按1：2(m/V)的比例加入4℃預冷的0.05mol/L磷酸鹽提取緩沖液(pH7.2)，勻漿(12000r/min，15s，每隔5s停1次)后，置4℃冰箱靜置抽提2h；在4℃條件下12000r/min離心60min，取上清液即得粗酶液。

1.3.2 硫酸銨分級沉淀

向粗酶液中加入硫酸銨粉末至30%飽和度，4℃鹽析2h，12000r/min離心35min收集上清；加入硫酸銨粉末至40%飽和度，4℃鹽析2h，6000r/min離心35min，收集沉淀；加入0.05mol/L磷酸鹽提取緩沖液(pH7.2)至沉淀完全溶解，4℃用0.05mol/L pH7.2磷酸鹽提取緩沖液(含1mmol/L的EDTA)透析過夜即得初酶液。

1.3.3 DEAE-Sepharose層析

經(jīng)0.05mol/L pH7.2磷酸緩沖液(含1mmol/L的EDTA)平衡層析柱后，初酶液加樣10mL，用0～1mol/L的NaCl溶液(含0.05mol/L，pH7.2的磷酸緩沖液，1mmol/L的EDTA)進行線性梯度洗脫，流速0.5mL/min，每管收集5mL；紫外檢測波長為280nm。測定各管過氧化氫酶液的活性和蛋白含量，收集活性較高的酶液。

1.3.4 Superdex-200層析

經(jīng)0.05mol/L pH7.2磷酸緩沖液(含1mmol/L的EDTA)平衡層析柱后，取上述活性較高的酶液，每次加樣4mL，用0.05mol/L pH7.2磷酸緩沖液(含1mmol/L的EDTA)緩沖液洗脫，流速0.3mL/min，每管收集3mL；測定各管過氧化氫酶液的活性和蛋白含量；收集活性較高的酶液，4℃去離子水透析脫鹽冷凍干燥后，獲得過氧化氫酶純品，―20℃冰箱保存。

1.3.5 CAT活力的測定

以過氧化氫為底物，按文獻[11]的方法測定。一個酶活力單位(U)定義為：在測定條件下，每分鐘催化分解1μmol過氧化氫所需的酶量。

1.3.6 CAT純度鑒定與分子質(zhì)量測定[12]

用SDS-PAGE電泳對該酶純度鑒定，12%的分離膠，加樣量為10μL。經(jīng)SDS-PAGE電泳和Superdex-200凝膠過濾層析分別測定該酶的亞基分子質(zhì)量和全分子質(zhì)量。

1.3.7 蛋白質(zhì)濃度的測定

用紫外分光光度法與考馬斯亮藍(Bradford)染料法測定[13]。

1.3.8 CAT性質(zhì)的測定

1.3.8.1 最適溫度和溫度穩(wěn)定性

分別測定該酶不同溫度20～75℃，間隔為5℃條件下的酶活力(在最適溫度條件下測得的酶活力作為100%)及將酶液分別放置在不同溫度25～65℃，間隔為10℃條件下，每隔1h測定酶活力(在25℃條件下原酶液的酶活力作為100%)，計算相對酶活力以確定該酶的最適溫度和溫度穩(wěn)定性。

分別測定不同pH4.0～10.6條件下的酶活力及將酶液分別放置在不同的pH值為4.0～10.6的緩沖液中，25℃條件下60min后測定酶活力，二者均以在最適條件下測得的酶活力作為100%，計算相對酶活力以確定該酶的最適pH值并研究其pH值穩(wěn)定性。

1.3.8.3 米氏常數(shù)(Km)的測定

配制不同濃度5、15、25、35、45mmol/L的過氧化氫，分別在最適溫度和最適pH值條件下測定各濃度底物條件下CAT的酶活力，采用雙倒數(shù)(Lineweaver-Burk)作圖法[14]確定該酶的Km值。

1.3.8.4 部分有機溶劑對CAT活性的影響

分別將甲醇、乙醇、異丙醇與磷酸鹽抽提緩沖液和酶液混勻(混勻后體積分數(shù)分別為10%、20%、30%、40%、50%、60%)，在4℃條件下放置30min，然后在最適條件下測定該酶的活性(采用等量的酶液和不加有機溶劑的該緩沖液混合時的酶活力為100%)。

1.3.8.5 部分化合物對CAT活性的影響

分別將尿素、KSCN、EDTA、ASA、SDS配成100mmol/L母液，按一定比例與磷酸鹽抽提緩沖液和酶液混合(混合后濃度分別為10、20、30、40mmol/L)，在4℃條件下放置30min，然后在最適條件下測定該酶的活性(采用等量的酶液和不加化合物的該緩沖液混合時的酶活力為100%)。

1.3.8.6 部分金屬離子對CAT活性的影響

基礎(chǔ)知識、個人能力、人際團隊能力和工程系統(tǒng)能力四個層面的能力是CDIO對學生的全面要求，采用綜合的培養(yǎng)方式使學生在這四個層面達到預定目標?，F(xiàn)今，已有多所世界著名高校加入了CDIO組織，在多個專業(yè)和領(lǐng)域，按照CDIO模式培養(yǎng)學生。在國內(nèi)，很多高校和專業(yè)已經(jīng)或正在展開CDIO工程教育模式的推廣和普及。

分別將部分金屬離子配成50mmol/L母液，按一定比例與去離子水和酶液混合(混合后的濃度分別為1、2、3、4、5mmol/L)，在4℃條件下放置30min，然后在最適條件下測定該酶的活性(采用等量的酶液和不加金屬離子的去離子水混合時的酶活力為100%)。

2 結(jié)果與分析

2.1 蒜苗CAT的分離純化

圖 1 蒜苗CAT的DEAE-Sepharose離子交換層析Fig.1 DEAE-Sepharose ion-exchange chromatography of catalase from garlic seedlings

圖 2 蒜苗CAT的Superdex-200凝膠過濾層析Fig.2 Superdex-200 gel fi ltration chromatography of catalase from garlic seedlings

表 1 蒜苗CAT的分離純化 Table 1 Summary of isolation and purification of catalase from garlic seedlings

由圖1可知，經(jīng)過DEAE-Sepharose離子交換層析進行線性梯度洗脫，且洗脫緩沖液中加入1mmol/L的EDTA后，保護了該酶的活性，同時與絕大多數(shù)雜蛋白分離開來。由圖2可知，經(jīng)Superdex-200凝膠過濾層析后雜蛋白和該酶進一步得到較好的分離。酶的整個純化過程如表1所示，該酶的比活力、回收率、純化倍數(shù)都相對較高，分別為25975.36U/mg、40.05%、125.97；純化后的CAT經(jīng)過SDS-PAGE電泳，考馬斯亮藍R-250染色，脫色后顯示為單一條帶(圖3)，表明分離純化后的該酶已為電泳純，達到了理想的分離效果。

2.2 過氧化氫酶分子質(zhì)量

圖 3 蒜苗CAT的SDS-PAGE電泳圖譜Fig.3 SDS-PAGE of purified catalase from garlic seedlings

由圖3可知，經(jīng)SDS-PAGE測得酶的亞基分子質(zhì)量為59.16kD。由圖4可知，經(jīng)Superdex-200凝膠過濾層析測得該酶的全分子質(zhì)量為234.93kD，由此說明蒜苗過氧化氫酶由4個相同的亞基構(gòu)成。

圖 4 Superdex-200凝膠過濾層析測蒜苗CAT的分子質(zhì)量Fig.4 Molecular weight estimation of catalase by Superdex-200 gel fi ltration chromatography

2.3 蒜苗CAT的部分理化性質(zhì)研究

2.3.1 最適作用溫度和熱穩(wěn)定性

圖 5 溫度對蒜苗CAT酶活力的影響Fig.5 Effect of temperature on catalase activity

由圖5可知，蒜苗過氧化氫酶的最適溫度為45℃，在20～55℃范圍內(nèi)該酶的活性均保持在90%以上。由圖6可知，該酶在25～45℃范圍內(nèi)的熱穩(wěn)定性較好，保溫5h相對酶活力均保持在85%以上，55℃保溫1h后相對酶活力不足30%，65℃時保溫1h后，相對酶活力基本為0。

圖 6 蒜苗CAT的熱穩(wěn)定性Fig.6 Temperature stability of catalase activity

2.3.2 最適作用pH值和pH值穩(wěn)定性

圖 7 pH值對蒜苗CAT活性的影響Fig.7 Effect of pH on catalase activity

圖 8 蒜苗CAT的pH值穩(wěn)定性Fig.8 pH stability of catalase activity

由圖7可知，蒜苗過氧化氫酶的最適pH值為7.2，在pH6.0～10.0范圍內(nèi)該酶的相對酶活力均保持在75%以上。由圖8可知，25℃保溫60min后，在pH5.0～10.0范圍內(nèi)該酶的相對酶活力均保持在80%以上，超出此范圍變化趨勢減緩，說明該酶能耐受較大范圍的pH值，對酸堿耐受性較好。

2.3.3 米氏常數(shù)(Km)的測定

由圖9可知，在最適條件下，以過氧化氫(5～45mmol/L、濃度間隔10mmol/L)為底物，測定該酶的相對酶活力，采用雙倒數(shù)法求得該酶的Km值為38.2mmol/L。

圖 9 雙倒數(shù)法測定蒜苗CAT的米氏常數(shù)Fig.9 Lineweaver-Burk plot for Km determination of catalase

2.3.4 部分有機溶劑對蒜苗CAT活性的影響

圖 10 甲醇、乙醇、異丙醇對蒜苗CAT酶活力的影響Fig.10 Effect of methanol, ethanol and isopropyl alcohol on catalase activity

由圖10可知，甲醇、乙醇、異丙醇均對該酶有一定的抑制作用，隨著三者體積分數(shù)逐漸增大，酶活性不斷被抑制，且甲醇對該酶抑制作用較強，當體積分數(shù)達到60%時，該酶活性基本完全喪失；乙醇和異丙醇對該酶抑制相對較弱。

2.3.5 不同化合物對蒜苗CAT活性的影響

圖 11 不同化合物對蒜苗CAT酶活力的影響Fig.11 Effect of various compounds on catalase activity

由圖11可知，在0～40mmol/L范圍內(nèi)，隨著尿素、KSCN、EDTA、ASA濃度的增加，尿素、EDTA、ASA對該酶活性影響不大，濃度達到40mmol/L時，相對酶活力均在95%以上；KSCN對該酶有一定的抑制作用；SDS對該酶抑制作用比較明顯，當其濃度達到20mmol/L時，該酶的活性基本完全喪失。

2.3.6 不同金屬離子對蒜苗CAT活性的影響

由圖12可知，在不同濃度范圍內(nèi)，不同金屬離子及同一金屬離子不同濃度對該酶活性的影響存在一定差異；Ca2+、Mg2+、Ba2+、Mn2+、Co2+、Cd2+、Zn2+對該酶有一定抑制作用；Ag+、Cu2+對該酶有非常顯著的抑制作用，當兩者的濃度達到1mmol/L時，該酶的活性完全喪失；Li+、Pb2+對該酶有較強的激活作用；K+對該酶的作用具有兩重性：低濃度時有一定的激活作用。

圖 12 不同金屬離子對蒜苗CAT酶活力的影響Fig.12 Effect of metal ions on catalase activity

3 討 論

本研究與其他材料分離純化過氧化氫酶相比，具有如下特點：1)四季可以取材，價格比較低廉。2)經(jīng)過DEAESepharose 離子交換層析后直接上Superdex-200凝膠過濾層析柱，減少了透析和冷凍干燥所帶來的酶活力損失，簡化了純化流程，節(jié)省了時間，同時得到電泳純的蒜苗過氧化氫酶；與韭菜[15]和發(fā)芽的黑綠豆[16]過氧化氫酶相比較，提高了該酶的比活力、酶活回收率和純化倍數(shù)(韭菜和發(fā)芽的黑綠豆過氧化氫酶的比活力為22064.57、5649U/mg，酶活回收率為18.33%、10.1%，純化倍數(shù)為70.36、23.3。本實驗蒜苗過氧化氫酶的比活力為25975.36U/mg、酶活回收率為40.05%、純化倍數(shù)為125.97)；純化倍數(shù)低于蘆薈[11]過氧化氫酶(純化倍數(shù)為228.05)。

該酶亞基分子質(zhì)量為59.16kD，與韭菜(62.43kD)[15]、蘆薈(60.6kD)[11]、獵犬狗肝臟(63kD)[17]等來源的CAT的亞基分子質(zhì)量接近，而不同于鷹嘴豆[18]CAT的同工酶的亞基分子質(zhì)量(97.4、66kD)，說明CAT的分子結(jié)構(gòu)具有物種特異性。

該酶的最適溫度為45℃，與蘆薈(45℃)[11]CAT的最適溫度一致，高于韭菜(37℃)[15]、鴨肝(40℃)[19]、褶皺冠蚌(25℃)[20]CAT的最適溫度，且熱穩(wěn)定性較好，在25～45℃范圍內(nèi)5h后酶活力均保持在85%以上；該酶的最適pH值為7.2，與韭菜(pH7.2)[15]一致，與蘆薈(pH7.5)[11]、鴨肝(pH7.0)[19]、褶皺冠蚌(pH7.0)[20]，發(fā)芽的黑綠豆(pH7.0)[16]重組大腸桿菌(pH7.0)[21]接近，說明不同材料中CAT對pH值環(huán)境具有相似的適應性；25℃保溫60min后，在pH5.0～10.0范圍內(nèi)該酶的活力均保持在80%以上，且pH4.0時為78%，pH10.6為62%遠高于其他生物[16-17,22-23]說明該酶對酸堿耐受范圍較好；Km為38.2mmol/L與鴨肝(37.29mmol/L)[19]，蘆薈(34mmol/L)[11]接近，遠低于氧化葡糖桿菌(61mmol/L)[23]、嗜熱子囊菌(48mmol/L)[24]、韭菜(46.93mmol/L)[15]，而遠高于發(fā)芽的黑綠豆(16.2mmol/L)[16]，說明不同材料中CAT的Km值不同，對底物過氧化氫的親和力存在一定的差異。

研究結(jié)果表明，甲醇、乙醇、異丙醇對該酶有一定抑制作用，且甲醇抑制作用較顯著；隨著三者體積分數(shù)的逐漸增大，酶活性不斷被抑制而下降，主要是因為不同濃度有機溶劑的加入破壞了該酶表面的水化層，使溶液的極性不斷降低，維持酶構(gòu)象的次級鍵遭到破壞，空間構(gòu)象的改變，導致該酶活性不斷下降甚至完全喪失。尿素、EDTA、ASA對該酶活性影響不大，其中EDTA在分離純化過程中對保護酶的活性起到十分重要的作用； 特別是在透析和層析過程中須加1mmol/L的EDTA，否則經(jīng)過透析和層析柱后酶活力將基本損失；KSCN對該酶有一定的抑制作用；SDS對該酶抑制作用比較明顯，與來源于韭菜[15]的一致，因SDS是一種變性劑，破壞該酶的疏水鍵和氫鍵，進而改變該酶的空間構(gòu)象，導致該酶活性喪失；Ca2+、Mg2+、Ba2+、Mn2+、Co2+、Cd2+、Zn2+對該酶有一定的抑制作用，Ag+、Cu2+對該酶有非常顯著的抑制作用，其中Cu2+與其他材料的CAT的結(jié)果相似[11,15,19]；Li+、Pb2+對該酶有一定的激活作用，其中Pb2+的性質(zhì)與韭菜[15]的一致；K+對該酶的作用具有兩重性：低濃度時有一定的激活作用，可能是由于一價的K+影響到該酶本身的帶電量，低濃度時可以促進底物與該酶的活性部位結(jié)合，形成底物-酶-離子復合物，激活該酶的活性，隨著K+濃度的不斷增大，K+的聚集改變該酶的帶電狀況，影響該酶的空間結(jié)構(gòu)，導致酶活性下降。

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