乳清分離蛋白美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的體外抗氧化特性

王文瓊，包怡紅*，陳 穎

(東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150040)

美拉德反應(yīng)又稱為“非酶褐變反應(yīng)”，主要是指食品中的氨基化合物(氨基酸、肽及蛋白質(zhì))與羰基化合物(糖類)之間發(fā)生的復(fù)雜反應(yīng)。美拉德反應(yīng)歷程復(fù)雜，產(chǎn)物中含有類黑精、還原酮及一系列含氮、硫的雜環(huán)化合物[1]。反應(yīng)經(jīng)過復(fù)雜的歷程，最終生成棕色甚至是黑色的大分子物質(zhì)——類黑精或稱擬黑素。Maillard在1912—1917年間對(duì)美拉德反應(yīng)做了卓有成效的研究，之后Hodge等[2]對(duì)該反應(yīng)的化學(xué)途徑進(jìn)行了研究和描述。

美拉德反應(yīng)產(chǎn)物(MRPs)的抗氧化性能是近年來國(guó)外食品營(yíng)養(yǎng)學(xué)、食品化學(xué)領(lǐng)域研究的熱門課題，而MRPs中的揮發(fā)性雜環(huán)化合物在其抗氧化性能方面起著重要作用[3]。近年來的研究表明，MRPs有很強(qiáng)的消除活性氧的能力。Hayase等[4]提出類黑精具有很強(qiáng)的消除活性氧的能力，可抑制脂類氧化。Morales等[5]研究發(fā)現(xiàn)賴氨酸-葡萄糖模式美拉德反應(yīng)產(chǎn)物清除DPPH自由基的能力與體系的熒光強(qiáng)度有很好的線性關(guān)系。Benjakul等[6]研究發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)-還原糖模式美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的還原力與褐變程度有良好的線性關(guān)系。趙艷娜等[7]研究發(fā)現(xiàn)乳清蛋白-乳糖復(fù)合物具有較高的的還原力及對(duì)DPPH自由基的清除能力。而乳清分離蛋白與小分子糖類反應(yīng)后的終產(chǎn)物對(duì)活氧自由基的清除能力國(guó)內(nèi)外未見報(bào)道。MRPs是食品加工和貯藏過程中產(chǎn)生的一類物質(zhì)，可以認(rèn)為是天然的，所以越來越多的學(xué)者主張制備MRPs加入食品體系或者應(yīng)用熱處理工藝促使食品形成MRPs，從而提高產(chǎn)品的抗氧化穩(wěn)定性。

近年來，我國(guó)干酪需要強(qiáng)勁，而發(fā)展干酪產(chǎn)業(yè)將產(chǎn)生大量乳清，目前我國(guó)尚缺乏乳清分離蛋白綜合利用相關(guān)技術(shù)。因此，迫切需要開發(fā)乳清分離蛋白綜合利用技術(shù)，以實(shí)現(xiàn)干酪產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。本研究利用乳清分離蛋白與小分子糖類發(fā)生的美拉德反應(yīng)，對(duì)乳清分離蛋白進(jìn)行改性，在改善乳清分離蛋白體外抗氧化活性的同時(shí)，為糖基化改性乳清分離蛋白作為天然抗菌劑、天然防腐劑和免疫增強(qiáng)劑提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

乳清分離蛋白(蛋白含量92.4%)，來自新西蘭；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、Tris-HCl 美國(guó)Sigma公司；其他試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

TGL-16C高速離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；UT-1810PC紫外-可見分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 乳清分離蛋白糖基復(fù)合物的制備

將乳清分離蛋白和木糖(X)、葡萄糖(G)、果糖(F)、乳糖(L)、蔗糖(S)、麥芽糖(M)，分別按質(zhì)量之比4：1、3：1、2：1、1：1、1：2、1：3溶解，制成總質(zhì)量濃度為60mg/mL的水溶液(pH6.86左右)，然后放入具塞試管中，并置于烘箱中，控制在50℃條件下進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)7d，即得乳清分離蛋白糖基復(fù)合物。

1.3.2 褐變程度分析

參照Ajandouz等[8]的方法。將待測(cè)樣品用蒸餾水進(jìn)行稀釋成質(zhì)量濃度為10mg/mL的溶液，測(cè)定其在420nm波長(zhǎng)處的吸光度。

1.3.3 還原能力測(cè)定

參照Oyaizu等[9]的方法。取60mg/mL 0.5mL樣品，加入0.2mol/L 2.5mL(pH6.6)磷酸鹽緩沖液和2.5mL 1g/100mL鐵氰化鉀溶液，混合均勻。50℃水浴中保持20min后冷卻，再加入2.5mL 10g/100mL三氯乙酸溶液，5500r/min離心10min。取2.5mL上層清液，加入2.5mL蒸餾水和0.5mL的0.1g/100mL氯化鐵溶液，混合均勻，靜置10min后，在700nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度。

1.3.4 清除DPPH自由基能力的測(cè)定

參照Brand-Williams等[10]的方法。將樣品稀釋至30mg/mL，取1.0mL樣品及4.0mL 0.12mmol/L的DPPH乙醇溶液(體積分?jǐn)?shù)為95%)，混勻，室溫下避光反應(yīng)30min，在5500r/min條件下離心5min。用體積分?jǐn)?shù)為95%乙醇溶液作參比，于517nm波長(zhǎng)測(cè)定吸光度。根據(jù)式(1)計(jì)算每種樣品液對(duì)DPPH自由基的清除率。

式中：Ai為加樣品液后DPPH溶液的吸光度；Aj為樣品液的吸光度；Ac為未加樣品液時(shí)DPPH溶液的吸光度。

1.3.5 清除·OH能力的測(cè)定

參照申衍豪等[11]的方法，向試管中加入樣品溶液30mg/mL 1.00mL、硫酸亞鐵溶液10mmol/L 1.00mL、水楊酸-乙醇10mmol/L 1.00mL、最后加入H2O2(0.03%)1.00mL啟動(dòng)反應(yīng)，振蕩混合，水浴37℃，保溫30min，5500r/min離心7min，在波長(zhǎng)510nm處測(cè)吸光度。

式中：Ac為樣品不加清除劑的吸光度；As為樣品加清除劑的吸光度；A0為空白管吸光度，以水代替樣品。

1.3.6 抗脂質(zhì)過氧化能力測(cè)定

根據(jù)Gu Fenglin等[12]的方法，制備脂質(zhì)體PBS分散體系(LLS)：30mg卵磷脂溶于10mmol/L 30mL LPBS(pH7.4)溶液中，超聲波處理得到均質(zhì)的脂質(zhì)體分散液。于樣品管中依次加入1mL LLS、1mL 400μm/L硫酸亞鐵溶液和1mL樣品，混勻。避光于37℃水浴60min，然后加入2mL的三氯乙酸(TCA)-硫代巴比妥酸(TBA)-鹽酸(HCl)混合液(TCA-TBA-HCl混合液，15g TCA、0.375g TBA、2.1mL HCl依次溶于100mL水中)，100℃水浴15min，冷卻，5500r/min離心10min，取上清液532nm波長(zhǎng)處測(cè)得吸光度。

式中：As為加樣品管吸光度；Ac為空白管吸光度，以水代替樣液。

1.3.7 清除O2－·能力的測(cè)定

參照傅亮等[13]的方法，取9mL 50mmol/L Tris-HCl緩沖溶液(pH 8.2)，0.6mL超純水，混勻后于25℃水浴中保溫20min，再加入25℃預(yù)熱的0.2mL 7.5mmol/L鄰苯三酚以10mmol/L HCl配制，空白管用10mmol/L HCl代替鄰苯三酚的鹽酸溶液，搖勻后倒入比色杯，在波長(zhǎng)325nm 處測(cè)定吸光度，計(jì)時(shí)3min后再次測(cè)定吸光度，計(jì)算吸光度增加值。在加入鄰苯三酚前，先加入一定體積的樣品溶液，相應(yīng)減少加入水的體積，其他操作如上。根據(jù)測(cè)定管吸光度的變化計(jì)算對(duì)O2－·的抑制率。

式中：ΔA0為鄰苯三酚自氧化3min內(nèi)增加值；ΔA為加入樣品溶液后鄰苯三酚自氧化3min內(nèi)增加值。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 乳清分離蛋白糖基化反應(yīng)褐變程度變化

不同比例的乳清分離蛋白-木糖(WPI-X)、乳清分離蛋白-葡萄糖(WPI-G)、乳清分離蛋白-果糖(WPI-F)、乳清分離蛋白-乳糖(WPI-L)、乳清分離蛋白-蔗糖(WPI-S)、乳清分離蛋白-麥芽糖(WPI-M)6種糖基化復(fù)合物與未處理的乳清分離蛋白反應(yīng)后的褐變程度分析，褐變程度結(jié)果如表1所示。

表 1 乳清分離蛋白糖基化復(fù)合物在420nm波長(zhǎng)處的吸光度Table 1 Change in absorbance of different glycosylated whey protein isolate at 420 nm

由表1可知，濕熱糖基化反應(yīng)后，不同乳清分離蛋白與糖質(zhì)量比的WPI-X復(fù)合物的A420nm明顯高于其他5種乳清分離蛋白糖基化復(fù)合物，差異顯著(P＜0.05)；且乳清分離蛋白與木糖在2：1的條件下反應(yīng)后A420nm高于其他比例的WPI-X復(fù)合物，差異顯著(P＜0.05)；乳清分離蛋白與葡萄糖、果糖在2：1條件下反應(yīng)后的吸光度與其他比例的吸光度差異顯著(P＜0.05)；糖基化反應(yīng)后，WPI-X復(fù)合物的顏色變化最大，顏色最深，為棕褐色；WPI-L、WPI-G為淡黃色；其他3種復(fù)合物的顏色較淺，為乳白色，而WPI-M復(fù)合物在A420nm大于WPI-G和WPI-L的吸光度，是因?yàn)槿榍宸蛛x蛋白與麥芽糖加熱后，液體變渾濁導(dǎo)致WPI-M吸光度變大，而其顏色沒有明顯變化。因此可得出，木糖的羰基反應(yīng)活性較高，比其他5種糖與乳清分離蛋白的濕熱糖基化反應(yīng)迅速。

2.2 乳清分離蛋白糖基化產(chǎn)物還原能力

乳清分離蛋白與6種不同糖基配體在不同質(zhì)量比例條件下進(jìn)行濕熱糖基化反應(yīng)后的還原能力，以及質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.01% VC的還原能力，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1所示。

圖 1 乳清分離蛋白及其糖基化產(chǎn)物的還原能力Fig.1 Reducing power of whey protein isolate and its glycosylated products

由圖1可知，乳清分離蛋白與6種糖基配體按不同質(zhì)量比混合，濕熱糖基化反應(yīng)后的還原能力差異顯著(P＜0.05)，糖基化反應(yīng)后，不同比例的WPI-X復(fù)合物與其他5種乳清分離蛋白糖基化復(fù)合物相比還原能力最高，且不同質(zhì)量比的WPI-X復(fù)合物的還原能力均高于0.01% VC的還原能力。在乳清分離蛋白與木糖和葡萄糖按質(zhì)量之比2：1條件下反應(yīng)后，還原能力均高于其他比例的混合物。因此可得出，乳清分離蛋白與木糖的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物是良好的電子供體，其供應(yīng)的電子不僅能使Fe3+還原成 Fe2+，同時(shí)能與自由基反應(yīng)，使自由基成為較為穩(wěn)定的物質(zhì)，從而中斷自由基連鎖反應(yīng)。

2.3 乳清分離蛋白糖基化產(chǎn)物對(duì)DPPH自由基清除能力

乳清分離蛋白與6種不同糖基配體在不同質(zhì)量比例條件下進(jìn)行濕熱糖基化反應(yīng)后對(duì)DPPH自由基清除能力，以及質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.01% VC的DPPH自由基清除能力，結(jié)果如圖2所示。

圖 2 乳清分離蛋白及其糖基化產(chǎn)物的DPPH自由基清除能力Fig.2 DPPH free radical scavenging activity of whey protein isolate and its glycosylated products

由圖2可知，乳清分離蛋白與6種糖基配體按不同質(zhì)量比混合，濕熱糖基化反應(yīng)后對(duì)DPPH自由基的清除能力差異顯著(P＜0.05)，糖基化反應(yīng)后，不同質(zhì)量比的WPI-X復(fù)合物與其他5種乳清蛋白糖基化復(fù)合物相比對(duì)DPPH自由基的清除能力最高。在乳清分離蛋白與木糖按質(zhì)量比2：1條件下反應(yīng)后，對(duì)DPPH自由基的清除能力均高于其他比例的混合物，DPPH試劑的紫色明顯減弱，吸光度降低。隨著乳清分離蛋白比例的降低，即隨糖基配體比例的增加，乳清蛋白糖基化復(fù)合物對(duì)DPPH自由基的清除能力增加，當(dāng)乳清分離蛋白與糖基配體的質(zhì)量比達(dá)到2：1時(shí)，對(duì)DPPH自由基的清除率達(dá)到最大，隨著糖基配體含量的增加，清除率下降。因此可以得出，糖基化反應(yīng)后抗氧化物質(zhì)的產(chǎn)生不僅與糖基配體的種類有關(guān)還與參與反應(yīng)的乳清分離蛋白與糖的質(zhì)量比有關(guān)。適宜比例的乳清分離蛋白與糖基配體混合物會(huì)促進(jìn)美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的積累，最終提高終產(chǎn)物對(duì)DPPH自由基的清除能力。

2.4 乳清分離蛋白糖基化產(chǎn)物對(duì)·OH清除能力

乳清分離蛋白與6種不同糖基配體在不同比例條件下進(jìn)行濕熱糖基化反應(yīng)后對(duì)·OH清除能力能力，以及質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.01% VC對(duì)·OH清除能力實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示。

圖 3 乳清分離蛋白及其糖基化產(chǎn)物清除·OH能力Fig.3 Hydroxyl radical scavenging activity of whey protein isolate and its glycosylated products

由圖3可知，乳清分離蛋白和6種不同比例的乳清分離蛋白糖基化復(fù)合物與質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.01%的VC相比對(duì)·OH的清除能力差異顯著(P＜0.05)，且明顯高于0.01% VC。濕熱糖基化反應(yīng)后，不同比例的糖基化復(fù)合物對(duì)·OH清除能力差異顯著(P＜0.05)；隨乳清分離蛋白比例的減少，反應(yīng)后糖基化復(fù)合物對(duì)·OH的清除能力逐漸遞減，而沒有增加的趨勢(shì)，說明大分子蛋白對(duì)·OH的清除能力高于糖基化終產(chǎn)物的清除能力，可能是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)分子質(zhì)量大，其對(duì)Fe2+螯合能力強(qiáng)，導(dǎo)致隨乳清蛋白在樣品中所占物質(zhì)的量增加時(shí)對(duì)·OH的清除能力也降低。6種糖基化復(fù)合物反應(yīng)后對(duì)·OH的清除能力均高于乳清分離蛋白。原因可能是，乳清分離蛋白質(zhì)分子糖基化以后，分子質(zhì)量增加，螯合Fe2+能力增強(qiáng)，使之不能產(chǎn)生·OH，阻止反應(yīng)的進(jìn)行，從而導(dǎo)致其清除能力變大[13-14]。

2.5 乳清分離蛋白糖基化產(chǎn)物抗脂質(zhì)過氧化能力

WPI與6種不同糖基配體在不同比例條件下進(jìn)行濕熱糖基化反應(yīng)后抗脂質(zhì)過氧化能力，以及質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.01%的BHA抗脂質(zhì)過氧化能力實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所示。

圖 4 乳清分離蛋白及其糖基化產(chǎn)物的抗脂質(zhì)過氧化能力Fig.4 Inhibitory effect of whey protein isolate and its glycosylated products on lipid peroxidation

由圖4可知，糖基化反應(yīng)后，WPI和6種不同比例的糖基化復(fù)合物與質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.01% BHA之間抗脂質(zhì)過氧化能力差異顯著(P＜0.05)，且低于0.01% BHA的抗脂質(zhì)過氧化能力。當(dāng)乳清分離蛋白與木糖按物質(zhì)的量之比2：1條件下反應(yīng)后，其抗脂質(zhì)過氧化能力略高于其他5種糖基化復(fù)合物。隨著乳清分離蛋白在混合物中所占比例的降低，乳清分離蛋白糖基化復(fù)合物抗脂質(zhì)過氧化能力逐漸降低；除在4：1條件下外，WPI-X和WPI-G復(fù)合物與其他復(fù)合物之間抗脂質(zhì)過氧化能力差異顯著(P＜0.05)，具有較高的抗脂質(zhì)過氧化能力。因此可以得出，乳清分離蛋白糖基化復(fù)合物的抗脂質(zhì)過氧化能力不僅與糖基配體的種類有關(guān)，還與參與反應(yīng)的蛋白與糖基配體的混合比例有關(guān)。另外，美拉德反應(yīng)產(chǎn)物十分復(fù)雜，關(guān)于其抗脂質(zhì)過氧化的機(jī)制目前還很難去解釋。在實(shí)際應(yīng)用中，張曦等[15]以乳清蛋白和木糖為原料制備可食用薄膜，對(duì)核桃仁進(jìn)行包裹，結(jié)果顯示：乳清蛋白-木糖美拉德反應(yīng)產(chǎn)物膜包裹可以延緩核桃仁酸價(jià)的上升，而乳清蛋白膜對(duì)核桃仁的酸價(jià)上升無明顯的抑制作用。

2.6 乳清分離蛋白糖基化產(chǎn)物對(duì)O2－·清除能力

乳清分離蛋白與6種不同糖基配體在不同質(zhì)量比條件下進(jìn)行濕熱糖基化反應(yīng)后對(duì)O2－·清除能力，以及質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.01%的VC對(duì)O2－·清除能力實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5所示。利用鄰苯三酚在堿性條件下能夠迅速自氧化，生成吸收波長(zhǎng)在318nm附近的系列中間產(chǎn)物，同時(shí)釋放出O2－·，此自由基能促進(jìn)鄰苯三酚自氧化，因此通過測(cè)定某物質(zhì)對(duì)鄰苯三酚的抑制作用，即可表征對(duì)其O2－·的清除作用[16]。

圖 5 乳清分離蛋白及其糖基化產(chǎn)物的清除O2－·能力Fig.5 Superoxide anion radical scavenging capacity of whey protein isolate and its glycosylated products

由圖5可知，不同比例的6種糖基化復(fù)合物和WPI與質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.01% VC之間對(duì)O2－·清除能力差異顯著(P＜0.05)，均低于質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.01% VC對(duì)O2－·的清除能力。隨乳清蛋白在混合物中所占比例的減少，反應(yīng)后的乳清蛋白糖基化復(fù)合物對(duì)O2－·的清除能力增加，當(dāng)乳清蛋白與糖基配體的混合比例達(dá)到2：1時(shí)，達(dá)到最大，隨著糖基配體含量的增加，糖基化反應(yīng)后產(chǎn)物對(duì)O2－·的清除能力降低。濕熱糖基化反應(yīng)后，不同比例的乳清蛋白和木糖混合物反應(yīng)后產(chǎn)物與其他5種糖基化復(fù)合物之間清除O2－·的能力差異顯著(P＜0.05)，且清除率最高，即對(duì)鄰苯三酚的自氧化具有較好的抑制作用。因此可以得出，乳清分離蛋白與糖參與的美拉德反應(yīng)進(jìn)行的程度以及，對(duì)O2－·的清除能力不僅與糖基配體的種類有關(guān)還與參與反應(yīng)的乳清蛋白與糖基配體的物質(zhì)的量比例有關(guān)。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)通過木糖、葡萄糖、果糖、乳糖、蔗糖、麥芽糖與乳清分離蛋白按不同質(zhì)量比混合進(jìn)行美拉德反應(yīng)，來研究乳清分離蛋白糖基化復(fù)合物在不同比例條件下的反應(yīng)終產(chǎn)物的褐變情況，還原能力以及抗氧化能力。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，美拉德反應(yīng)產(chǎn)物(MRPs)中的高相對(duì)分子質(zhì)量(Mw＞3500)部分如類黑素具有清除自由基的抗氧化作用并與420nm的光吸收值相關(guān)[17-18]；且褐變程度越深，其還原能力、清除DPPH自由基能力、清除O2－·能力以及抗脂質(zhì)過氧化能力越強(qiáng)。另外適當(dāng)比例的乳清分離蛋白與糖基配體混合經(jīng)美拉德反應(yīng)會(huì)促進(jìn)美拉德反應(yīng)終產(chǎn)物類黑精、還原酮及一些含N、S的雜環(huán)化合物等具有較強(qiáng)的抗氧化活性物質(zhì)的積累，增強(qiáng)乳清分離蛋白體外抗氧化能力。而且從以上結(jié)果可以看出，美拉德反應(yīng)不僅與乳清蛋白與糖基配體參與反應(yīng)的質(zhì)量比有關(guān)，還與參與反應(yīng)的糖的種類有關(guān)，其中乳清分離蛋白與蔗糖美拉德反應(yīng)程度最低，其體外抗氧化能力也最低，WPI與木糖美拉德反應(yīng)程度最大，其體外抗氧化能力也最強(qiáng)。因此可以看出，還原型五碳糖(木糖)參與美拉德反應(yīng)的活性明顯高于還原性六碳糖。具有抗氧化能力的糖基化改性乳清分離蛋白的研究為開發(fā)食用油脂微膠囊功能性壁材以及可使用保鮮膜的研究開辟了新的途徑，改性乳清分離蛋白的這一功能特性是普通抗氧化劑VC所不能達(dá)到的。

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