不同加熱方法對(duì)牛肉酶解蛋白與葡萄糖反應(yīng)活性的影響

吳 肖，孔令會(huì)，于立梅

(1.廣東匯香源生物科技股份有限公司，廣東 廣州 510663；2.仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院輕工食品學(xué)院，廣東 廣州 510225)

動(dòng)物蛋白是形成豐滿圓潤(rùn)醇厚口感的重要物質(zhì)之一[1]。當(dāng)動(dòng)物蛋白酶解后經(jīng)過不同能量方式作用，其風(fēng)味形成和釋放機(jī)理存在差異[2-5]，在這個(gè)過程中參與的主要反應(yīng)為蛋白質(zhì)、肽和氨基酸的分解和降解作用以及Maillard反應(yīng)，因而對(duì)不同加熱方法中蛋白類物質(zhì)反應(yīng)活性以及風(fēng)味物質(zhì)形成和釋放規(guī)律研究具有重要意義。牛肉風(fēng)味是肉類風(fēng)味研究中最為廣泛和深入的一種，主要集中的領(lǐng)域?yàn)椋号Ｈ怙L(fēng)味主要貢獻(xiàn)活性香氣化合物以及結(jié)構(gòu)研究[6]、12-甲基十三醛濃度對(duì)動(dòng)物生長(zhǎng)發(fā)育的影響[7]、煮制牛肉肉質(zhì)特性與芳香成分的影響[8]、煮制牛肉芳香成分、新噻唑類化合物等的鑒定[9-11]、存在煮制牛肉中的硫化合物的分離和鑒定[12]、烤制牛肉中芳香成分的鑒定[13]、肉制品加工和模擬肉味風(fēng)味研究[14-15]，而對(duì)于牛肉呈味物質(zhì)的研究較少。牛肉蛋白質(zhì)經(jīng)酶解后形成一定分子質(zhì)量分布的蛋白質(zhì)、肽和氨基酸，通過加入葡萄糖進(jìn)行Maillard熱反應(yīng)后形成牛肉風(fēng)味類芳香物質(zhì)。但是不同蛋白質(zhì)、肽和氨基酸與葡萄糖的反應(yīng)活性不同，而且未反應(yīng)的酶解物和形成的牛肉風(fēng)味物質(zhì)呈味性能不同，相對(duì)于世界范圍內(nèi)牛肉蛋白風(fēng)味物質(zhì)在不同反應(yīng)體系中消長(zhǎng)規(guī)律的研究，我國的研究起步較晚，我國源遠(yuǎn)流長(zhǎng)的食文化對(duì)風(fēng)味物質(zhì)的研究提出迫切的需求。本實(shí)驗(yàn)以四川甘孜州的新鮮牦牛肉作為原料，經(jīng)過相同的酶解工藝，分別運(yùn)用不同的加熱方法(微波、高壓、熱空氣流、水蒸氣)和葡萄糖反應(yīng)一段時(shí)間，對(duì)其產(chǎn)物進(jìn)行風(fēng)味物質(zhì)的釋放規(guī)律的分析研究，為牛肉類風(fēng)味物質(zhì)的進(jìn)一步研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牛肉，四川甘孜州牦牛肉。

復(fù)合蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶 諾和諾德酶制劑公司；葡萄糖 廣州澤明科技發(fā)展有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

JJ1000型電子天平 常熟市雙杰測(cè)試儀器廠；LZB-4WB型玻璃轉(zhuǎn)子流量計(jì) 寧波市科奧流量?jī)x表有限公司；JB90-D電動(dòng)攪拌器 上海標(biāo)本模型廠；ZCY-15A型恒溫油浴鍋 寧波天恒儀器廠；空氣凈化濾膜 上海名列化工科技有限公司；S-608型增氧泵 中山市日勝電器制品有限公司；高效液相色譜裝置 美國Waters公司；自制微波反應(yīng)裝置、自制高壓反應(yīng)釜。

1.3 實(shí)驗(yàn)工藝

牛肉與水的質(zhì)量比為1：1，預(yù)先攪碎稱其總質(zhì)量，加入牛肉蛋白質(zhì)總質(zhì)量0.5%的復(fù)合蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶，在(55±1)℃的條件下酶解2h，然后再加入與牛肉蛋白質(zhì)總質(zhì)量相同量的葡萄糖，分別放入不同的熱反應(yīng)體系中進(jìn)行反應(yīng)，然后進(jìn)行感官品評(píng)，選擇牛肉風(fēng)味和香氣較好的一組進(jìn)行圖譜分析。

1.4 實(shí)驗(yàn)體系

1.4.1 體系1-微波熱反應(yīng)體系

將上述反應(yīng)原料放入裝有電動(dòng)攪拌器的自制微波反應(yīng)設(shè)備中，設(shè)定溫度為(100±1)℃，待溫度上升至指定溫度時(shí)，開始計(jì)時(shí)，分別選取10、15、20、25、30min停止反應(yīng)，迅速冷卻至常溫，稱其質(zhì)量，保持質(zhì)量恒定，低溫保存。所得樣品進(jìn)行感官品評(píng)，選出牛肉香味得分最高一組，用高效液相色譜測(cè)定其分子質(zhì)量分布曲線圖。

1.4.2 體系2-高壓熱反應(yīng)體系

將上述反應(yīng)原料放入自制的高壓反應(yīng)釜中，設(shè)定壓力為1.5kgf，待壓力上升至指定壓力時(shí)開始計(jì)時(shí)，分別選取30、50、70、90、110min停止反應(yīng)，迅速冷卻至常溫，稱其質(zhì)量，保持質(zhì)量恒定，低溫保存。所得樣品進(jìn)行感官品評(píng)，選出牛肉香味得分最高一組，用高效液相色譜測(cè)定其分子質(zhì)量分布曲線圖。

1.4.3 體系3-熱空氣流熱反應(yīng)體系

將上述反應(yīng)原料放入自制氣升式反應(yīng)器中，設(shè)定溫度為(100±1)℃，通入預(yù)處理熱空氣并計(jì)時(shí)，分別選取30、50、70、90、110min停止反應(yīng)，迅速冷卻至常溫，稱其質(zhì)量，保持質(zhì)量恒定，低溫保存。所得樣品進(jìn)行感官品評(píng)，選出牛肉香味得分最高一組，用高效液相色譜測(cè)定其分子質(zhì)量分布曲線圖。

1.4.4 體系4-水蒸氣熱反應(yīng)體系

將上述反應(yīng)原料放入水蒸氣發(fā)生器中，設(shè)定溫度為(100±1)℃，并開始計(jì)時(shí)，分別選取30、50、70、90、110min停止反應(yīng)，迅速冷卻至常溫，稱其質(zhì)量，保持質(zhì)量恒定，低溫保存。所得樣品進(jìn)行感官品評(píng)，選出牛肉香味得分最高一組，用高效液相色譜測(cè)定其分子質(zhì)量分布曲線圖。

1.5 分析方法

采用高效液相色譜分析柱對(duì)牛肉制備液的分子組成種類分子質(zhì)量分布及含量進(jìn)行測(cè)定，分析條件：柱溫38℃，C18色譜柱：40mm×125mm，流動(dòng)相：V(甲醇)：V(乙腈)=1：2；檢測(cè)器：UV波長(zhǎng)338nm；流速：1mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)：254nm。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的出峰保留時(shí)間，峰面積和分子質(zhì)量首先確定分子質(zhì)量擬合曲線，然后根據(jù)擬合曲線，通過保留時(shí)間計(jì)算所測(cè)各蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量及相對(duì)含量，這種計(jì)算程序已經(jīng)輸入高效液相色譜分析程序，所以蛋白質(zhì)分子質(zhì)量分布及相對(duì)含量的結(jié)果直接輸出。

1.6 感官品評(píng)設(shè)計(jì)

感官測(cè)評(píng)后選中的每個(gè)樣品制作3次，混勻過膠體磨，然后對(duì)每一個(gè)樣品采用3位數(shù)字進(jìn)行隨機(jī)編碼，每一組包括3個(gè)樣品，每一個(gè)樣品在50℃恒溫水浴鍋中恒溫一段時(shí)間，然后沖成體積分?jǐn)?shù)1%，倒入一次性淺口塑料杯，在聞香室由嗅聞小組成員打分，每一個(gè)樣品被不同的成員嗅聞3次(包括品嘗)，根據(jù)得分取其平均值。得分采用60分制，即最高為60分，最低為0分，每10分為一個(gè)級(jí)別。感官嗅聞之后取得分在30及以上分之間的單因素范圍條件進(jìn)行高效液相測(cè)定分子質(zhì)量分布分析。其中嗅聞小組成員是由經(jīng)過專門訓(xùn)練的調(diào)香師或者反應(yīng)工程師組成，總共13人。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶解牛肉色譜圖

圖 1 酶解牛肉蛋白色譜圖Fig.1 Chromatogram of beef enzymatic protein

由圖1 可知，牛肉經(jīng)過一段時(shí)間酶解后，大于10000D的蛋白類物質(zhì)占0.29%(小于10.88min)，5000～9999D(10.88～16.09min)的蛋白類物質(zhì)占73.21%，3000～4999D(16.09～19.93min)的蛋白類物質(zhì)占12.92%，1000～2999D(19.93～28.18min)的蛋白類物質(zhì)占13.58%，小于999D(大于28.19min)的蛋白類物質(zhì)沒有，說明該牛肉經(jīng)過酶解之后，牛肉蛋白的立體空間結(jié)構(gòu)已經(jīng)被破壞，2～10個(gè)分子的寡肽幾乎不存在，主要以多肽和寡聚肽的形式存在。

2.2 微波熱反應(yīng)體系色譜圖

表 1 微波熱反應(yīng)體系感官品評(píng)結(jié)果Table 1 Results of sensory analysis in microwave system

由表1可知，15min時(shí)所得牛肉風(fēng)味較協(xié)調(diào)，有牛肉本味，烤味稍有增強(qiáng)，并無碳化和焦糊等不愉快風(fēng)味，因而選取該樣品進(jìn)行色譜分析，所得譜圖如圖2所示。

圖 2 牛肉酶解液在微波體系中分子質(zhì)量分布色譜圖Fig.2 Molecular weight distribution chromatogram of beef enzymatic protein in microwave system

由圖2可知，牛肉酶解液在微波體系中反應(yīng)后，大于10000D的蛋白類物質(zhì)占6.45%，5000～9999D的蛋白類物質(zhì)占2.97%，3000～4999D的蛋白類物質(zhì)占81.98%，1000～2999D的蛋白類物質(zhì)占8.43%，小于999D的蛋白類物質(zhì)沒有。在該體系中，大于10000D的牛肉蛋白類物質(zhì)含量升高，說明5000～9999D區(qū)間物質(zhì)部分發(fā)生聚合作用。而3000～4999D的牛肉蛋白類物質(zhì)明顯升高，5000～9999D區(qū)間物質(zhì)發(fā)生強(qiáng)烈降解和分解作用。1000～2999D區(qū)間物質(zhì)降低，說明部分發(fā)生聚合作用和Maillard反應(yīng)，降解和分裂作用并不明顯。體現(xiàn)良好牛肉風(fēng)味物質(zhì)分布在1000～4999D之間，主要集中于3000～4999D區(qū)間。在酸水解和酶解的植物蛋白中，國外也有相關(guān)牛肉風(fēng)味研究[16-17]，但是兩者明顯的區(qū)別在于反應(yīng)底物差異性較大，所得牛肉風(fēng)味的逼真性區(qū)別也很明顯。

2.3 高壓熱反應(yīng)體系色譜圖

表 2 高壓熱反應(yīng)體系感官品評(píng)結(jié)果Table 2 Results of sensory analysis in high pressure system

由表2可知，70min時(shí)所得牛肉風(fēng)味較協(xié)調(diào)，有熟牛肉本味，整體肉味飽滿協(xié)調(diào)，沒有碳化、焦糊、銹金屬和熱反應(yīng)的酸氣等不愉快風(fēng)味，因而選取該樣品進(jìn)行色譜分析。

圖 3 牛肉酶解液在高壓熱反應(yīng)體系中反應(yīng)后的分子質(zhì)量分布圖譜Fig.3 Molecular weight distribution chromatogram of beef enzymatic protein in high pressure system

由圖3可知，肉酶解液在高壓熱反應(yīng)體系中反應(yīng)后大于10000D的蛋白類物質(zhì)占60.87%，5000～9999D的蛋白類物質(zhì)和小于999D的蛋白類物質(zhì)沒有，3000～4999D的蛋白類物質(zhì)占27.95%，1000～2999D的蛋白類物質(zhì)占11.18%，在該體系中大于10000D的牛肉蛋白類物質(zhì)明顯高于酶解牛肉，說明在該體系中聚合作用明顯增強(qiáng)，尤其是5000～9999D的多肽聚合作用強(qiáng)烈，部分該區(qū)間的牛肉酶解蛋白物質(zhì)發(fā)生降解作用。該樣品烤香不明顯，主要體現(xiàn)純牛肉香氣和口感，說明該體系Maillard反應(yīng)趨勢(shì)不明顯。

2.4 熱空氣流熱反應(yīng)體系色譜圖

表 3 熱空氣流熱反應(yīng)體系感官品評(píng)結(jié)果Table 3 Results of sensory analysis in the flow of hot air system

由表3可知，70min時(shí)所得牛肉風(fēng)味飽滿協(xié)調(diào)，有干蒸牛肉干本味，稍有烤味，沒有碳化和焦糊等不愉快風(fēng)味，因而選取該樣品進(jìn)行色譜分析。

圖 4 牛肉酶解液在熱空氣流體系中反應(yīng)后的分子質(zhì)量分布圖譜Fig.4 Molecular weight distribution chromatogram of beef enzymatic protein in the fl ow of hot air system

由圖4可知，牛肉酶解液在熱空氣流體系中反應(yīng)后，大于5000D和小于999D的蛋白類物質(zhì)為0，3000～4999D的蛋白類物質(zhì)占85.52%，1000～2999D的蛋白類物質(zhì)占14.48%，說明在該體系中，分子質(zhì)量大于5000D的牛肉酶解蛋白類物質(zhì)主要發(fā)生降解和分解作用，而分子質(zhì)量小于999D的牛肉酶解蛋白類物質(zhì)的聚合作用似乎也不明顯。與葡萄糖的反應(yīng)活性主要集中于1000～4999D的牛肉酶解蛋白類物質(zhì)中，但是Maillard反應(yīng)趨勢(shì)明顯弱于降解和分解作用。體現(xiàn)牛肉香氣和醇厚牛肉口感的活性物質(zhì)主要分布于1000～4999D區(qū)間，主要集中于3000～4999D。該樣品稍微具有烤味。

2.5 水蒸氣熱反應(yīng)體系色譜圖

表 4 水蒸氣熱反應(yīng)體系感官品評(píng)結(jié)果Table 4 Results of sensory analysis in water vapor system

由表4可知，50min時(shí)所得牛肉風(fēng)味突出而且協(xié)調(diào)飽滿，沒有生腥味，也無其他不愉快風(fēng)味，因而選取該樣品進(jìn)行色譜分析。

圖 5 牛肉酶解液在水蒸氣熱反應(yīng)體系中反應(yīng)后的分子質(zhì)量分布圖譜Fig.5 Polymerization of tyrosine and ferulaic acid catalysis by POD

由圖5可知，牛肉酶解液在水蒸氣熱反應(yīng)體系中反應(yīng)后，大于10000D和小于999D的蛋白類物質(zhì)為0，5000～9999D的蛋白類物質(zhì)占0.48%，3000～4999D的蛋白類物質(zhì)占80.67%，1000～2999D的蛋白類物質(zhì)占18.85%，在該體系中牛肉風(fēng)味物質(zhì)的消長(zhǎng)規(guī)律接近于熱空氣流能量場(chǎng)體系，主要作用方式是5000～9999D區(qū)間物質(zhì)發(fā)生強(qiáng)烈降解和分解作用。3000～4999D區(qū)間物質(zhì)降解和分解作用也比較顯著，因而1000～2999D區(qū)間的物質(zhì)含量增高。Maillard反應(yīng)在整個(gè)區(qū)間都不明顯。體現(xiàn)良好牛肉風(fēng)味物質(zhì)主要分布在1000～4999D。

3 結(jié) 論

經(jīng)過一定程度水解的牛肉蛋白質(zhì)，分子質(zhì)量分布主要在5000～9999D的寡肽和多肽形式存在的牛肉蛋白質(zhì)，運(yùn)用不同加熱方式，與葡萄糖進(jìn)行熱反應(yīng)的活性存在差異，因而形成的牛肉風(fēng)味也存在差異。不同熱處理方法的熱反應(yīng)體系中，牛肉酶解蛋白類物質(zhì)發(fā)生變化的方式不同，主要是降解和分解作用、聚合作用，而Maillard反應(yīng)作用方式不太顯著，這可能與分子質(zhì)量大小和分子反應(yīng)活性有關(guān)。體現(xiàn)牛肉風(fēng)味物質(zhì)分布于1000～4999D區(qū)間，主要集中于3000～4999D之間。在這個(gè)區(qū)間的牛肉酶解液與葡萄糖在高壓，熱空氣流和水蒸氣熱處理方式作用下形成的牛肉風(fēng)味物質(zhì)烤香不明顯，主要體現(xiàn)良好的牛肉味，無其他不良風(fēng)味。

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