響應(yīng)面法優(yōu)化長雙歧桿菌增殖培養(yǎng)基

孫 鵬，趙旭博，孫先鋒，馬永征

(1.西安工程大學(xué)環(huán)境與化學(xué)工程學(xué)院，陜西 西安 710048；2.西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 楊凌 712100；3.北京市食品研究所，北京 100162)

雙歧桿菌是廣泛存在于人體和動物腸道內(nèi)的有益菌，具有促進(jìn)機(jī)體對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，調(diào)節(jié)腸道菌群平衡，增強(qiáng)免疫力，抗癌及抗腫瘤，降低血脂、保護(hù)及改善肝功能、調(diào)理腸道內(nèi)環(huán)境、抗衰老、通便等功能[1-3]，但要實(shí)現(xiàn)上述功能，產(chǎn)品中的雙歧桿菌在保質(zhì)期內(nèi)必須保持在106CFU/mL(106CFU/g)以上[4]，因此提高雙歧桿菌的活菌數(shù)是產(chǎn)品開發(fā)的關(guān)鍵，培養(yǎng)基優(yōu)化是提高活菌數(shù)的常用手段之一。

目前雙歧桿菌活菌數(shù)的提高主要通過在培養(yǎng)基中添加果蔬汁如胡蘿卜汁、番茄汁、平菇汁、卷心菜汁等[5-9]，益生元如低聚果糖、菊糖及魔芋葡萄甘露低聚糖等[10-12]，蛋白質(zhì)及其水解產(chǎn)物如酪蛋白水解物、乳清蛋白水解物、乳鐵蛋白及乳清蛋白等[13-16]等來實(shí)現(xiàn)，或以天然提取物如菊芋汁、麥芽汁等[17-19]為培養(yǎng)基主要成分通過培養(yǎng)基優(yōu)化來提高雙歧桿菌活菌數(shù)。如韓雪等[5]從海帶汁、平菇汁及胡蘿卜汁等果蔬汁中篩選了兩株雙歧桿菌的增殖因子，并通過正交試驗(yàn)進(jìn)行了雙歧桿菌培養(yǎng)基的優(yōu)化；劉子宇等[6]以TPYG培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，采用響應(yīng)面法優(yōu)化了Bifidobacterium breve A04培養(yǎng)基；杜鵬等[7]采用采用單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)優(yōu)化了嬰兒雙歧桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基；胡德亮等[18]研究了菊芋對雙歧桿菌促生長的影響；孫記錄等[19]篩選優(yōu)化了菊芋汁雙歧桿菌培養(yǎng)基；Oliveira等[10]研究發(fā)現(xiàn)添加菊糖能縮短嗜熱乳鏈球菌和乳雙歧桿菌酸乳發(fā)酵時(shí)間，并提高了活菌數(shù)；Prasanna等[13]研究了乳清蛋白水解物等幾種氮源對長雙歧桿菌和嬰兒雙歧桿菌生長和產(chǎn)多糖的影響，發(fā)現(xiàn)在脫脂乳中添加1.5%酪蛋白水解物能促進(jìn)雙歧桿菌的生長；Kim等[15]研究發(fā)現(xiàn)牛乳鐵蛋白能促進(jìn)短雙歧桿菌、嬰兒雙歧桿菌和兩歧雙歧桿菌的生長；Janer等[16]研究發(fā)現(xiàn)酪蛋白巨肽(caseinomacropeptide，CMP)和乳清蛋白濃縮物(whey protein concentrate，WPC)能促進(jìn)乳雙歧桿菌的生長，乳中添加20g/L CMP在37℃條件下培養(yǎng)24h能使活菌數(shù)提高1.5(lg(CFU/g))，添加20g/L WPC可使乳雙歧桿菌活菌數(shù)對數(shù)值達(dá)到9.1(lg(CFU/g))。

但添加果蔬汁會導(dǎo)致培養(yǎng)基配制步驟增加，操作繁瑣，不適宜用于工業(yè)化。文獻(xiàn)中添加益生元一般僅選擇添加某一種低聚糖或菊糖，沒有考慮各種低聚糖或菊糖對該菌株生長的影響。此外，沒考慮在培養(yǎng)基中添加氨基酸對雙歧桿菌生長的影響。本研究以長雙歧桿菌為實(shí)驗(yàn)對象，通過碳源、益生元及氨基酸單因素試驗(yàn)及Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)篩選出主因子，再通過爬坡試驗(yàn)、Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及響應(yīng)面分析對長雙歧桿菌的增殖培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，以提高活菌數(shù)，為進(jìn)一步開發(fā)雙歧桿菌產(chǎn)品奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株長雙歧桿菌(Bifidobacterium longum) 西安工程大學(xué)環(huán)境與化學(xué)工程學(xué)院菌種室保藏。

1.1.2 培養(yǎng)基與試劑

活化培養(yǎng)基：MRS肉湯，并添加0.5g/L濾膜過濾除菌的半胱氨酸鹽酸鹽；計(jì)數(shù)培養(yǎng)基：MRS瓊脂；基礎(chǔ)培養(yǎng)基：無碳源MRS肉湯。

葡萄糖、乳糖、麥芽糖、蔗糖、低聚果糖、低聚木糖、低聚異麥芽糖、低聚半乳糖、水蘇糖及菊糖 西安羅森伯生物科技有限公司；氨基酸 美國Sigma公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SW-CJ-1F無菌操作臺 蘇州凈化設(shè)備有限公司；DH5000AB電熱恒溫培養(yǎng)箱 天津市泰斯特儀器有限公司；756PC紫外-可見分光光度計(jì) 上海光譜儀器有限公司；BS224S型電子天平 德國賽多利斯公司；PHS-3C型酸度計(jì) 上海精科儀器有限公司；厭氧裝置(厭氧培養(yǎng)罐、產(chǎn)氣袋及氧氣指示劑) 日本三菱公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種活化

將半胱氨酸鹽酸鹽配成濃溶液，然后采用0.22μm的濾膜過濾除菌，再將其添加到滅菌冷卻后的MRS肉湯中，使其終質(zhì)量濃度為0.5g/L，將其用來活化凍干的長雙歧桿菌菌粉，37℃厭氧培養(yǎng)24h，按體積分?jǐn)?shù)5%接種量接種，活化3次后備用。

1.3.2 培養(yǎng)基優(yōu)化

根據(jù)生長曲線確定培養(yǎng)時(shí)間，同時(shí)首先通過單因素試驗(yàn)分別考察4種碳源(乳糖、葡萄糖、蔗糖和麥芽糖)、6種益生元(低聚果糖、低聚異麥芽糖、低聚木糖、低聚半乳糖、水蘇糖和菊糖)、8種氨基酸(亮氨酸、谷氨酸、精氨酸、蛋氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸和絲氨酸)對長雙歧桿菌生長的影響，獲得能促進(jìn)長雙歧桿菌生長的物質(zhì)，再采用Plackett-Burman(PB)試驗(yàn)篩選主因子，接著進(jìn)行爬坡試驗(yàn)確定最大活菌數(shù)區(qū)域，最后通過Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及響應(yīng)面分析確定最佳培養(yǎng)基組成，Plackett-Burman和Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及數(shù)據(jù)處理均利用Design Expert 8.06軟件完成。

1.3.3 OD值及pH值測定

采用紫外-可見分光光度計(jì)法測定培養(yǎng)液在600nm波長處的濁度(OD600nm值)，未接入菌的培養(yǎng)基作為對照。通過PHS-3C酸度計(jì)測定培養(yǎng)液pH值。

1.3.4 活菌數(shù)測定

培養(yǎng)液采用10倍梯度稀釋，選取適當(dāng)稀釋度傾注平板，使其均勻分布于培養(yǎng)基中，37℃厭氧培養(yǎng)48h后計(jì)數(shù)菌落數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 長雙歧桿菌生長曲線

將已活化好的長雙歧桿菌按照體積分?jǐn)?shù)5%接種量接入含0.5g/L半胱氨酸鹽酸鹽的MRS肉湯中，充分混勻后37℃培養(yǎng)24h，每隔2h取樣測定其在600nm波長處的OD600nm值、培養(yǎng)液pH值及活菌數(shù)，以這3個(gè)指標(biāo)繪制生長曲線，如圖1所示。

圖 1 長雙歧桿菌在MRS肉湯中的生長曲線Fig.1 Growth curve of Bifi dobacterium longum in MRS broth

由圖1可知，0～4h為長雙歧桿菌生長的延滯期，然后進(jìn)入對數(shù)生長期，至18h進(jìn)入穩(wěn)定期，然后進(jìn)入衰亡期，最佳培養(yǎng)時(shí)間為18h，此時(shí)活菌數(shù)為8.96×108CFU/mL，OD600nm值為1.154，pH值為5.15。在培養(yǎng)18h后，活菌數(shù)逐漸下降，而OD600nm繼續(xù)增加，pH值緩慢降低，但18h后的OD600nm值不能反映培養(yǎng)液中的活菌數(shù)，18h之前的OD600nm值曲線和活菌數(shù)曲線趨勢一致，因此在穩(wěn)定期前的OD600nm值能反映長雙歧桿菌的生長情況。在后續(xù)的單因素試驗(yàn)中測定18h的OD600nm值來判斷各物質(zhì)對長雙歧桿菌生長的影響。

2.2 碳源、益生元及氨基酸對長雙歧桿菌生長的影響

2.2.1 碳源對長雙歧桿菌生長的影響

在無碳源的MRS肉湯中分別加入葡萄糖、乳糖、麥芽糖和蔗糖，并將質(zhì)量濃度分別調(diào)整為10、15、20、25、30g/L，118℃滅菌20min，冷卻后加入過濾除菌的半胱氨酸鹽酸鹽，再按體積分?jǐn)?shù)5%的接種量接入長雙歧桿菌，37℃條件下恒溫培養(yǎng)18h后測定OD600nm值，結(jié)果如圖2所示。

圖 2 碳源對長雙歧桿菌生長的影響Fig.2 Effect of carbon source on the growth of B. longum

由圖2可知，隨著碳源添加量的增加，培養(yǎng)液的OD600nm值均先增大后減小，在葡萄糖、乳糖及麥芽糖質(zhì)量濃度為20g/L及蔗糖質(zhì)量濃度為15g/L時(shí)，培養(yǎng)液的OD600nm值達(dá)到最大值，分別為1.146、1.190、1.024、0.987，說明長雙歧桿菌對這4種糖的利用率大小順序?yàn)槿樘牵酒咸烟牵钧溠刻牵菊崽?，其中碳源為蔗糖及麥芽糖時(shí)不利于長雙歧桿菌的生長，其OD600nm值與葡萄糖和乳糖作為碳源的結(jié)果存在顯著性差異(P＜0.05)，同時(shí)，葡萄糖和乳糖的最大OD600nm值間也存在顯著性差異(P＜0.01)，因此乳糖為該菌的最佳碳源，在后續(xù)研究中以乳糖為該菌的碳源。

2.2.2 益生元對長雙歧桿菌生長的影響

圖 3 益生元對長雙歧桿菌生長的影響Fig.3 Effect of prebiotics on the growth of B. longum

在以20g/L乳糖為碳源的MRS肉湯中分別加入低聚果糖、低聚木糖、低聚異麥芽糖、低聚半乳糖、水蘇糖及菊糖6種益生元，并將質(zhì)量濃度分別調(diào)整為2、4、6、8、10g/L，118℃滅菌20min，冷卻后加入過濾除菌的半胱氨酸鹽酸鹽，再按體積分?jǐn)?shù)5%的接種量接入長雙歧桿菌，37℃條件下恒溫培養(yǎng)18h后測定OD600nm值及pH值，結(jié)果如圖3所示。隨著益生元添加量的增加，培養(yǎng)液的OD600nm值均出現(xiàn)了先增加后降低的情況，但均高于對照，說明益生元的添加能促進(jìn)長雙歧桿菌的生長。培養(yǎng)液OD600nm值最大時(shí)的益生元添加量分別為低聚果糖4g/L、低聚木糖2g/L、低聚異麥芽糖6g/L、低聚半乳糖8g/L、水蘇糖2g/L及菊糖4g/L，對應(yīng)的OD600nm值分別為1.149、1.275、1.081、1.184、1.093及1.269，其中低聚異麥芽糖和水蘇糖添加量對該菌的生長沒有顯著的促進(jìn)作用(P＞0.05)，其他4種益生元均能顯著性促進(jìn)該菌的生長(P＜0.05)，其中以低聚木糖最佳、其次為菊糖和低聚異麥芽糖，最后為低聚果糖。

2.2.3 氨基酸對長雙歧桿菌生長的影響

將以20g/L乳糖為碳源的MRS滅菌冷卻后，分別加入過濾除菌的亮氨酸、谷氨酸、精氨酸、賴氨酸、蛋氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸及絲氨酸8種氨基酸的濃溶液，并將其質(zhì)量濃度均調(diào)整為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5g/L，然后加入過濾除菌的半胱氨酸鹽酸鹽，最后按體積分?jǐn)?shù)5%的接種量接入長雙歧桿菌，37℃條件下恒溫培養(yǎng)18h后測定OD600nm值及pH值，結(jié)果如圖4所示。

圖 4 氨基酸對長雙歧桿菌生長的影響Fig.4 Effect of amino acid on the growth of B. longum

由圖4可知，隨著氨基酸添加量的增加，培養(yǎng)液的OD600nm值均出現(xiàn)了先增加后降低的情況。培養(yǎng)液OD600nm值最大時(shí)的氨基酸添加量為：亮氨酸0.2g/L、谷氨酸0.3g/L、精氨酸0.2g/L、賴氨酸0.2g/L、蛋氨酸0.3g/L、脯氨酸0.1g/L、苯丙氨酸0.4g/L及絲氨酸0.3g/L，對應(yīng)的最大值分別為1.062、1.121、1.058、1.111、1.132、1.130、1.148及1.063，其中亮氨酸、精氨酸及絲氨酸對該菌的生長沒有顯著的促進(jìn)作用(P＞0.05)，其他5種氨基酸均能顯著性促進(jìn)該菌的生長(P＜0.05)，其中以苯丙氨酸最佳、其次為蛋氨酸和脯氨酸，最后為谷氨酸和賴氨酸。

2.3 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)篩選主要影響因子

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選用N=12的Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)對低聚木糖、菊糖、低聚異麥芽糖、低聚果糖、苯丙氨酸、蛋氨酸、脯氨酸、谷氨酸和賴氨酸9個(gè)因素進(jìn)行考察，每個(gè)因素取高(+1)低(－1)兩個(gè)水平，高水平約為低水平的1.25倍，響應(yīng)值為單位體積中長雙歧桿菌活菌數(shù)的對數(shù)值(Y)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表1，其中X6和X11為虛擬項(xiàng)；因素水平取值、效應(yīng)及顯著性分析見表2。

表 1 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 1 Experimental results of Plackett-Burman design

表 2 Plackett-Burman試驗(yàn)結(jié)果及方差分析Table 2 The levels of Plackett-Burman tests and analvsis of variance

由表2可知，在培養(yǎng)長雙歧桿菌的過程中，在α=0.10的顯著水平上，低聚木糖、菊糖和脯氨酸添加量對長雙歧桿菌活菌數(shù)的對數(shù)值影響顯著，其中低聚木糖和菊糖添加量對培養(yǎng)液中雙歧桿菌活菌數(shù)對數(shù)值的影響為負(fù)效應(yīng)，脯氨酸為正效應(yīng)，可考慮作為主要因素進(jìn)一步做響應(yīng)面試驗(yàn)。

2.4 爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

表 3 最陡爬坡試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Results of the steepest ascent experiment

響應(yīng)面擬合方程只有在考察的鄰近區(qū)域里才能充分近似真實(shí)情況，所以應(yīng)先逼近最大影響區(qū)域后再建立有效的擬合方程。根據(jù)PB試驗(yàn)結(jié)果，針對低聚木糖、菊糖和脯氨酸添加量進(jìn)行最陡爬坡實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如表3所示。各因素的取值在第3組(0+2Δ)附近時(shí)培養(yǎng)液中長雙歧桿菌活菌數(shù)對數(shù)值最高，故采用低聚木糖1.6g/L、菊糖3.4g/L和脯氨酸0.4g/L為后續(xù)響應(yīng)面試驗(yàn)的中心點(diǎn)。

2.5 響應(yīng)面設(shè)計(jì)確定顯著影響因素的最佳值

根據(jù)最陡爬坡試驗(yàn)確定的試驗(yàn)因素中心點(diǎn)，采用Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)對長雙歧桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，各因素水平選擇如表4所示，其結(jié)果如表5所示。

表 4 Box-Behnken試驗(yàn)因素水平及其編碼Table 4 Fractors, levels and codes of Box-Behnken design

表 5 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 5 Experimental design and results of Box-Behnken tests

根據(jù)表5中Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果，采用Design Expert 8.06軟件響應(yīng)面分析程序?qū)ζ溥M(jìn)行回歸擬合，得到二次多元回歸模型為：Y=9.22+0.041A+0.038B+0.010C－0.00008AB+0.010AC+0.0099BC－0.43A2－0.019B2－0.014C2，對二次模型進(jìn)行方程分析，結(jié)果如表6所示。模型P=0.0042＜0.01，失擬項(xiàng)P=0.1595＞0.05，相關(guān)系數(shù)R2=96.38%，表明模型的相關(guān)性很好，R2Adj相關(guān)系數(shù)為89.85%，表明響應(yīng)面的89.85%的變化可以由此模型解釋，模型與實(shí)際情況擬合的很好。變異系數(shù)CV越低，試驗(yàn)的可信度和精確度越高，變異系數(shù)為0.18，試驗(yàn)數(shù)據(jù)可靠，分析結(jié)果可信，因此可以用此回歸方程對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析和預(yù)測。

表 6 模型回歸方程方差分析Table 6 Analysis of variance of regression equations

由表6還可看出，在α=0.05的顯著水平上，A、B、及A2是顯著的，AC(低聚木糖和脯氨酸)及BC(菊糖和脯氨酸)有一定的交互作用，但均不顯著。利用Design-Expert軟件對回歸模型進(jìn)行響應(yīng)面分析，得到各響應(yīng)面的二維等高線和三維立體圖(圖5～7)，等高線圖的圓心越接近橢圓表示交互作用越強(qiáng)，等高線的稀疏表示響應(yīng)面圖形的平陡。由3組圖可知，增殖培養(yǎng)基中長雙歧桿菌活菌數(shù)的對數(shù)值在設(shè)定的濃度范圍內(nèi)都有一個(gè)最大值，采用Design-Expert軟件的Optimization模塊，對增殖培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，在各物質(zhì)實(shí)驗(yàn)添加量的范圍內(nèi)，預(yù)測低聚木糖、菊糖及脯氨酸添加量分別為1.7、3.6、0.4g/L時(shí)，長雙歧桿菌活菌數(shù)對數(shù)值的最大值為9.2489。采用上述最優(yōu)添加量培養(yǎng)長雙歧桿菌，實(shí)際獲得5組平行實(shí)驗(yàn)平均發(fā)酵液中長雙歧桿菌活菌數(shù)為(1.75±0.02)×109CFU/mL，其對數(shù)值為9.244±0.006，與預(yù)測值接近，可見該模型能較好地預(yù)測實(shí)際發(fā)酵液中長雙歧桿菌活菌數(shù)的對數(shù)值。

圖 5 低聚木糖與菊糖對長雙歧桿菌生長影響的等高線圖及響應(yīng)面圖Fig.5 Surface and contour plots for the effect of xylooligosaccharide and inulin on the growth of B. longum

圖 6 低聚木糖與脯氨酸對長雙歧桿菌生長影響的等高線圖及響應(yīng)面圖Fig.6 Surface and contour plots for the effect of xylooligosaccharide and proline on the growth of B. longum

圖 7 菊糖與脯氨酸對長雙歧桿菌生長影響的等高線圖及響應(yīng)面圖Fig.7 Surface and contour plots for the effect of inulin and proline on the growth of B. longum

3 結(jié) 論

實(shí)驗(yàn)證明，Plackett-Burman設(shè)計(jì)與響應(yīng)面方法(RSM)相結(jié)合的試驗(yàn)統(tǒng)計(jì)方法能快速、有效地從眾多影響長雙歧桿菌液體培養(yǎng)的因素中篩選出比較重要的影響因素，并實(shí)現(xiàn)條件優(yōu)化，得到最佳營養(yǎng)，優(yōu)化結(jié)果與實(shí)際培養(yǎng)情況吻合較好。

通過單因素試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)長雙歧桿菌的最佳碳源為乳糖，低聚木糖、菊糖、低聚異麥芽糖、低聚果糖、苯丙氨酸、蛋氨酸、脯氨酸、谷氨酸及賴氨酸能顯著促進(jìn)長雙歧桿菌的生長。利用Design Expert 8.06軟件進(jìn)行了主要影響因子篩選和響應(yīng)面優(yōu)化，主要影響因子為低聚果糖、菊糖及脯氨酸，優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基為：將MRS中的碳源葡萄糖替換為乳糖20g/L，再加入低聚木糖1.7g/L、菊糖3.6g/L、脯氨酸0.4g/L和半胱氨酸鹽酸鹽0.5g/L，37℃厭氧培養(yǎng)18h后其活菌數(shù)達(dá)(1.75±0.02)×109CFU/mL，比優(yōu)化前提高了95.64%。

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