低溫條件下冷卻豬肉中假單胞菌生長模型的比較分析

牛會敏，李苗云*，趙改名，張秋會，田 瑋，黃現(xiàn)青，柳艷霞，張建威，高曉平，孫靈霞

(河南省肉制品加工與質(zhì)量安全控制重點實驗室，河南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，河南 鄭州 450002)

近年來，冷卻豬肉逐漸發(fā)展成為我國生鮮肉消費的主流，國內(nèi)外關(guān)于冷卻豬肉中假單胞菌生長預(yù)測模型已經(jīng)做了大量研究[1-4]。在預(yù)測微生物學(xué)領(lǐng)域，修正的Gompertz、Baranyi、Logistic及Huang等初級模型常被用來描述微生物數(shù)量隨時間的變化關(guān)系，在已有的研究中，大都選用單一的模型來描述假單胞菌數(shù)量隨時間變化的函數(shù)關(guān)系。盡管很多不同的非線性方程被當(dāng)做模型用來預(yù)測微生物的生長，但并不能確定哪一種模型可以在本質(zhì)上更優(yōu)于其他模型[5]。在模型選擇上很多學(xué)者做出了相當(dāng)多得努力，一些比較研究文獻(xiàn)也有報道[6-9]，然而有必要直接采用以實際食品為培氧基質(zhì)而培養(yǎng)的微生物數(shù)據(jù)來評價常用初級模型的統(tǒng)計擬合能力。

本實驗選擇3種常用的初級模型來擬合由冷卻豬肉復(fù)雜微生物體系中直接測定的假單胞菌生長數(shù)據(jù)，用殘差值分布圖及殘差平方和(residual sum of squares，RSS)，殘差標(biāo)準(zhǔn)誤(residual standard error，RSE)及赤池信息量準(zhǔn)則(akaike information criterion，AIC)等統(tǒng)計指標(biāo)來綜合比較分析3種模型擬合托盤包裝冷卻豬肉中假單胞菌生長的情況，為冷卻豬肉假單胞菌預(yù)測預(yù)報體系模型選擇提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

冷卻豬肉豬背最長肌 河南漯河雙匯集團(tuán)。

假單胞菌瓊脂(CM0559、SR0103E，PE真空包裝袋) 英國Oxoid公司。

1.2 儀器與設(shè)備

HVE-50壓力蒸汽滅菌鍋 日本Hirayama公司；SPX-1505H-Ⅱ生化培養(yǎng)箱 上海新苗醫(yī)療器械公司；SW-CJ-2F潔凈工作臺 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；MIR-254 低溫恒溫培養(yǎng)箱 日本Sanyo公司；VORTEX-2 GENIE 渦旋振蕩器 美國Scientific Industries公司。

1.3 方法

1.3.1 取樣及貯藏

從雙匯集團(tuán)分割生產(chǎn)線隨即采取豬背最長肌，用保鮮膜包裹，放置裝有冰袋的保溫箱中，迅速轉(zhuǎn)運至實驗室。修去筋腱后，將肉無菌切成小塊，按質(zhì)量稱取每袋220g左右進(jìn)行真空包裝，在0、5、10℃條件下貯藏。貯藏在0℃條件下的冷卻豬肉，每隔48h取樣測定假單胞菌；5℃貯藏的樣品每隔24h取樣測定；10℃貯藏的樣品每隔12h取樣測定。

1.3.2 冷卻豬肉中假單胞菌的計數(shù)方法

無菌操作稱取25g樣品，用剪刀剪碎后置于裝有225mL的8.5%滅菌生理鹽水的錐形瓶中，充分振搖，取100μL按1：10進(jìn)行倍比稀釋，之后按照修改的6×6點樣法[10]進(jìn)行微生物測定。每組樣品做5次平行。

1.3.3 微生物生長動力學(xué)模型

在預(yù)測微生物學(xué)領(lǐng)域，預(yù)測模型是按數(shù)學(xué)模型進(jìn)行分類的，初級模型表征的就是在一定生長環(huán)境和條件下微生物數(shù)量隨時間變化的關(guān)系。選擇3種常用的初級模型來擬合低溫條件下冷卻豬肉中假單胞菌的生長數(shù)據(jù)。

修正的Gompertz模型是經(jīng)驗?zāi)Ｐ停畛醪皇窃O(shè)計用來描述微生物生長，只是模型中的參數(shù)被賦予了物理含義來解釋微生物的生長參數(shù)，而這些參數(shù)在建立和解釋模型時都發(fā)揮了重要作用，此模型因使用簡單而被廣泛應(yīng)用于預(yù)測微生物的生長。為了直接與另外兩個生物學(xué)基礎(chǔ)的模型進(jìn)行比較，本實驗用自然對數(shù)值取代常用對數(shù)值，修正的Gompertz模型直接表述為：

式中：Y是t時微生物的自然對數(shù)值(ln(CFU/g))；Nmax和N0分別是Y的初始值、最大值；μG是在時間M時的相對最大生長速率；M是達(dá)到相對最大生長速率所需要的時間。恒溫條件下遲滯期λ和生長速率K可根據(jù)公式(2)、(3)計算。

由Baranyi等[11]在1994年提出的Baranyi模型得到了越來越廣泛的應(yīng)用，其最大的優(yōu)點就是擬合性較高，并且使用方便；動態(tài)環(huán)境也可以使用；適合多種情況；模型中的參數(shù)都具有生理學(xué)意義，是真正意義上的動力學(xué)模型。其方程描述如下。

式中：N0和ymax分別是Y的初始值、最大值；K是生長速率。

遲滯期的計算根據(jù)公式(5)，參數(shù)h0只是使曲線擬合更適宜的原始數(shù)據(jù)的一個中間轉(zhuǎn)換[12]。

最后選擇的是Huang模型[13]，該模型來源于恒溫條件下微生物生長情況的3個階段(遲滯期、對數(shù)期、穩(wěn)定期)，公式可以描述為式(6)、(7)。

公式中參數(shù)的生物學(xué)意義同Baranyi模型。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Excel分別計算每個樣品假單胞菌數(shù)取對數(shù)值后的平均值[平均lg()][14]，每個樣品假單胞菌取平均值后的對數(shù)值(N)，假單胞菌平均值的估計值(lgA)。

式中：k為lg菌落數(shù)；s為標(biāo)準(zhǔn)差。

采用SAS的統(tǒng)計軟件對假單胞菌的生長數(shù)據(jù)進(jìn)行非線性回歸擬合。目前，并沒有一個單獨并簡單的統(tǒng)計方法來評價非線性模型之間的異同及如何優(yōu)先選擇一個模型這個問題。一般情況下，主要選擇殘差分析和擬合度等統(tǒng)計標(biāo)準(zhǔn)來評價不同非線性模型之間的比較，從而綜合評價模型的整體擬合能力[15]。本實驗用殘差分析、RSS、RSE及AIC來整體評價3種模型的擬合能力。RSS和RSE值越小，模型擬合效果越好。采用Excel軟件對擬合的生長曲線進(jìn)行繪圖。

式中：n為實驗數(shù)據(jù)的總數(shù)；p為模型中參數(shù)的個數(shù)；RSS為殘差平方和；n為數(shù)據(jù)的總數(shù)；m為模型中參數(shù)的個數(shù)。AIC是衡量統(tǒng)計模型擬合優(yōu)良性的一種標(biāo)準(zhǔn)，在不同的溫度條件下對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，AIC值最小的模型是最準(zhǔn)確的[16]。

2 結(jié)果與分析

2.1 低溫條件下冷卻豬肉中假單胞菌的生長特點

假單胞菌屬是嗜冷菌，一直被認(rèn)為是在有氧條件下引起冷卻肉腐敗的主導(dǎo)作用菌[17-18]。由圖1可知，3組溫度下假單胞菌的初始菌值分別是11.81(ln(CFU/g))、8.65(ln(CFU/g))和9.25(ln(CFU/g))，從遲滯期的細(xì)節(jié)圖2可以明顯看出，托盤包裝冷卻豬肉中假單胞菌在低溫條件下(0、5、10℃)出現(xiàn)明顯的菌數(shù)下降趨勢，隨后呈現(xiàn)典型“S”形生長。可能是樣品經(jīng)歷了從企業(yè)到實驗室的溫度波動歷程后，低溫貯藏抑制了假單胞菌的生長，導(dǎo)致假單胞菌數(shù)量的下降。另外，假單胞菌是冷卻豬肉屠宰過程中污染的微生物，在豬肉這種新環(huán)境適應(yīng)過程中，細(xì)胞由于不適應(yīng)新環(huán)境生長導(dǎo)致了死亡速率大于生長速率，從而出現(xiàn)了初始假單胞菌數(shù)量下降的趨勢[19]。

圖 1 0(a)、5(b)、10℃(c)條件下冷卻豬肉中假單胞菌觀測值及擬合曲線Fig.1 Growth fitting curves of Pseudomonas in chilled pork at 0(a), 5 ℃(b) and 10 ℃(c)

圖 2 0(a)、5(b)、10℃(c)條件下冷卻豬肉中假單胞菌遲滯期細(xì)節(jié)圖Fig.2 lg phase of Pseudomonas in chilled pork at 0(a), 5 ℃(b) and 10 ℃(c)

2.2 3種模型統(tǒng)計指標(biāo)的比較分析

2.2.1 殘差分布的分析

圖 3 0(a)、5(b)、10℃(c)條件下3種模型擬合的冷卻豬肉中假單胞菌數(shù)據(jù)的相對殘差值分布圖Fig.3 Distribution of relative residuals for three kinetics models for Pseudomonas growth in chilled pork at 0(a), 5 ℃(b) and 10 ℃(c)

由圖3可知，在0℃條件下，3種模型的殘差值均圍繞殘差等于零的直線上下隨即分布，這說明回歸曲線對原觀測值的擬合情況良好。而相對于修正的Gompertz和Huang模型來說，Baranyi模型擬合的殘差值分布更集中，在±0.3的范圍內(nèi)波動，說明在0℃條件下，Baranyi模型能更準(zhǔn)確地預(yù)測冷卻豬肉中假單胞菌的生長狀況。在5℃條件下，修正的Gompertz模型擬合的殘差值分布相對集中，在殘差值等于零的直線上下隨即分布，范圍波動在±0.4以內(nèi)，說明在此溫度下，修正的Gompertz模型能更準(zhǔn)確的預(yù)測冷卻豬肉中假單胞菌的生長情況。同樣的分析在10℃條件下，Huang模型是預(yù)測假單胞菌生長最準(zhǔn)確的選擇。

2.2.2 擬合度統(tǒng)計指標(biāo)的分析

表1反映的是低溫條件下3種模型擬合的統(tǒng)計指標(biāo)的比較分析。可以看出，在0℃條件下，Baranyi模型擬合的RSS、AIC和RSE值是最小的，5℃條件下修正的Gompertz模型擬合的RSS、AIC和RSE值是最小的，而10℃條件下，擬合出最小RSS、AIC和RSE值的卻是Huang模型，3種模型中的任何一個模型都不能同時對所有溫度下的實驗數(shù)據(jù)表現(xiàn)出最佳的擬合能力。Baty等[20]在5～42℃范圍內(nèi)的不同條件下，比較了修正的Gompertz、Baranyi和Lag-exponential模型對15個數(shù)據(jù)庫里關(guān)于混合大腸桿菌O157：H7菌株生長數(shù)據(jù)的擬合情況，得出沒有一個模型可以對所有的數(shù)據(jù)表現(xiàn)出持續(xù)的最佳擬合能力。

表 1 3種模型擬合的各項統(tǒng)計指標(biāo)的比較分析Table 1 Comparative analysis of statistical parameters obtained from three growth models

目前國內(nèi)外報道的研究中大多是采用單一的某一個模型對微生物進(jìn)行預(yù)測，如楊紅菊[21]、何帆[22]等均選用修正的Gompertz函數(shù)對不同包裝方式冷卻豬肉中的假單胞菌建立了動力學(xué)生長預(yù)測模型；Sivila[23]、Radovan[24]等使用Baranyi模型分別建立了有氧條件下生鮮禽肉中假單胞菌的生長預(yù)測模型。Koutsoumanis等[25]結(jié)合溫度和pH值的影響使用Baranyi分別建立了豬肉和牛肉中假單胞菌的生長預(yù)測模型。

對于建立微生物預(yù)測模型的數(shù)據(jù)收集來說，用液體培養(yǎng)基培養(yǎng)與實際肉品不同，肉湯培養(yǎng)基體系穩(wěn)定，不考慮原料組織對微生物的影響，大都采用確定的某一個模型進(jìn)行建模；而實際肉品中微生物生長體系復(fù)雜，通過自然污染的原料肉直接測定的數(shù)據(jù)考慮了肉中復(fù)雜的微生物生長環(huán)境，能更真實的反映微生物的生長情況，因此有必要研究此環(huán)境下的微生物生長預(yù)測模型。

目前肉中假單胞菌的生長大都單獨采用單一的模型進(jìn)行預(yù)測，對于冷卻豬肉來說，不同溫度下哪種模型更適用于預(yù)測假單胞菌的生長并不清楚。本實驗直接以托盤包裝的冷卻豬肉作為研究對象，假單胞菌出現(xiàn)初始菌值下降趨勢的特點；選用不同的模型對數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，找出了不同溫度下預(yù)測假單胞菌生長的最適模型，Baranyi模型是0℃最適的，而5℃和10℃條件下的最適模型分別是修正的Gompertz和Huang模型。因此，通過以上分析和討論可知，對于復(fù)雜的肉品體系而言，不同的溫度條件下應(yīng)該選擇最適合的模型而不是單一的模型來預(yù)測假單胞菌的生長，這也為冷卻豬肉實際生產(chǎn)中建立假單胞菌的預(yù)測預(yù)報體系提供了理論依據(jù)。

3 結(jié) 論

低溫條件下，托盤包裝冷卻豬肉中假單胞菌數(shù)量在遲滯期出現(xiàn)初始菌值下降的趨勢。在0、5、10℃條件下擬合冷卻豬肉中假單胞菌生長的最適模型分別是Baranyi、修正的Gompertz和Huang模型。在對冷卻豬肉中假單胞菌進(jìn)行預(yù)測時，不同的溫度條件下應(yīng)該選擇最適合的模型而不是單一的模型來預(yù)測假單胞菌的生長。

[1] 姜英杰, 鄒曉葵, 吳菊清. 假單胞菌在豬肉上生長預(yù)測模型的建立與驗證[J]. 貴州農(nóng)業(yè)科學(xué), 2010, 38(8)： 141-145.

[2] 李苗云. 冷卻豬肉中微生物生態(tài)分析及貨架期預(yù)測模型的研究[D]. 南京： 南京農(nóng)業(yè)大學(xué), 2006.

[3] 姜英杰. 假單胞菌和大腸桿菌在冷卻豬肉中生長預(yù)測模型的建立[D]. 南京： 南京農(nóng)業(yè)大學(xué), 2008.

[4] LIU Fang, YANG Runqing, LI Yunfei. Correlation between growth parameter of spoilage microorganisms and shelf-life of pork stored under air and modified atmosphere at－2, 4 and 10 ℃[J]. Food Microbiology, 2006, 23： 578-583.

[5] LóPEZ S, PRIETO M, DIJKSTRA J, et al. Statistical evaluation of mathematical models for microbial growth[J]. International Journal of Food Microbiology, 2004, 96： 289-300.

[6] ZWIETERING M H, JONGENBURGER I, ROMBOUTS F M, et al. Modeling of the bacterial growth curve[J]. Applied and Environment Microbiology, 1990, 56： 1875-1881.

[7] BUCHANAN R L, WHITING R C, DAMERT W C. When is simple good enough： a comparison of the Gompertz, Baranyi, and threephase linear models for fitting bacterial growth curves[J]. Food Microbiology, 1997, 14： 313-326.

[8] SCHEPERS A W, THIBAULT J, LACROIX C. Comparison of simple neural networks and nonlinear regression models for descriptive modeling of Lactobacillus helveticus growth in pH-controlled batch cultures[J]. Enzyme and Microbial Technology, 2000, 26： 431-445.

[9] DALGAARD P, KOUTSOUMANIS K. Comparison of maximum specific growth rates and lag times estimated from absorbance and viable count data by different mathematical models[J]. Journal of Microbiology of Methods, 2001, 43： 183-196.

[10] CHEN C Y, NACE G W, IRWIN P L. A 6 × 6 drop plate method for simultaneous colony counting and MPN enumeration of Campylobacter jejuni, Listeria monocytogenes, and Escherichia coli[J]. Journal of Microbiological Methods, 2003, 55： 475-479.

[11] BARANYI J, ROBERTS T A. A dynamic approach to predicting bacterial growth in food[J]. International Journal of Food Microbiology, 1994, 23： 277-294.

[12] BARANYI J, ROBINSON T P, KALOTI A, et al. Predicting growth of Brochothrix thermosphacta at changing temperature[J]. International Journal of Food Microbiology, 1995, 27： 61-75.

[13] HUANG Lihan. Growth kinetics of Listeria monocytogenes in broth and beef frankfurtermal-determination of lag phase duration and exponential growth rate under isothermal conditions[J]. Journal of Food Science, 2008, 73： 235-242.

[14] KILSBY D C, PUGH M E. The relevance of the distribution of microorganisms within batches of food to the control of microbiological hazards from foods[J]. Journal of Application Bacteriology, 1981, 51： 345-354.

[15] LóPEZ S, PRIETO M, DIJKSTRA J, et al. Statistical evaluation of mathematical models for microbial growth[J]. International Journal of Food Microbiology, 2004, 96： 289-300.

[16] MOTULSKY H J, CHRISSTOPOULOS A. Fitting models to biological data using linear and nonlinear regression[M]. San Diego： A Practical Guide to Curve Fitting, GraphPad Software, 2003.

[17] GILL C O, NEWTON K G. The development of aerobic spoilage flora on meat stored at chill temperature[J]. Journal of Applied Microbiology, 1977, 43： 189-195.

[18] GILL C O, NEWTON K G. The ecology of bacterial spoilage of fresh meat at chill temperature[J]. Meat Science, 1978, 2： 207-217.

[19] YATES G T, SMOTZER T. On the lag phase and initial decline of microbial growth curves[J]. Journal of Theoretical Biology, 2007, 244： 511-517.

[20] BATY F, DELIGENETTE-MULLER M L. Estimating the bacterial lag time： which model, which precision?[J]. International Journal of Food Microbiology, 2004, 91： 261-277.

[21] 楊紅菊, 南慶賢. 冷卻豬肉主要腐敗微生物生長模型的建立[J]. 前沿科技, 2004, 4(3)： 7-10.

[22] 何帆, 徐幸蓮, 周光宏. 不同包裝條件下冷卻豬肉品質(zhì)特征指標(biāo)及動態(tài)模型研究[J]. 食品科學(xué), 2010, 31(24)： 473-478.

[23] SILVIA A, DONALD W. Development and validation of a mathematical model to describe the growth of Pseudomonas spp. in raw poultry stored under aerobic conditions[J]. International Journal of Food Microbiology, 2007, 120： 287-295.

[24] RADOVAN G, JUDITH K, STEFANIE B, et al. Mathematical modeling for predicting the growth of Pseudomonas spp. in poultry under variable temperature conditions[J]. International Journal of Food Microbiology, 2008, 127： 290-297.

[25] KOUTSOUMANIS K, STAMATION A, SKANDAMIS P, et al. Development of a microbial model for the combined effect of temperature and pH on spoilage of ground meat, and validation of the model under dynamic temperature conditions[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2006, 72： 124-134.