凌棗黃酮提取及自由基清除能力研究

李秀霞，孫協(xié)軍，馮彥博，李 嬌，勵(lì)建榮

（渤海大學(xué)化學(xué)化工與食品安全學(xué)院，遼寧錦州121013）

凌棗又稱鈴棗，其果樹(shù)耐寒、抗貧瘠，適應(yīng)性強(qiáng)，是遼西地區(qū)的特色栽培品種，主要分布在遼寧省凌源市。凌棗果實(shí)脆甜，凌棗棗果富含多糖、氨基酸和多種維生素及礦物質(zhì)，屬鮮食品種。有研究表明，凌棗中總黃酮含量為棗果之首[1]，主要包括蘆丁、藥黃素和黃酮-C-葡萄糖苷等黃酮類化合物等[2]。這些黃酮類生物活性物質(zhì)具有很高的營(yíng)養(yǎng)保健價(jià)值，可起到消炎止咳、降血壓、降血脂、增進(jìn)冠狀動(dòng)脈血流量和防治冠心病、心絞痛等作用，經(jīng)常食用有增進(jìn)人體健康的功效。對(duì)凌棗功能性成分進(jìn)行開(kāi)發(fā)利用，對(duì)于促進(jìn)凌源棗業(yè)的發(fā)展和滿足人們對(duì)天然保健食品的需求具有重要的意義。本實(shí)驗(yàn)以遼西凌棗黃酮為研究對(duì)象，探討不同部位凌棗黃酮的含量和抗氧化活性，為凌棗功能性食品的研究和應(yīng)用開(kāi)發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

凌棗 購(gòu)于當(dāng)?shù)厥袌?chǎng)；蘆丁 色譜純，中國(guó)生物制品檢定所；2，2-二苯基苦基苯肼（DPPH） 美國(guó)Sigma-aldrich公司；鄰二氮菲 天津市大茂化學(xué)試劑廠；焦性沒(méi)食子酸 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；三氟乙酸 天津大茂化學(xué)試劑廠；其他試劑 均為分析純。

P680型液相色譜儀 美國(guó)戴安公司；AD雙反型超純水機(jī) 上海訊輝環(huán)?？萍加邢薰?；TU1901型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 北京普析通用儀器公司；A-2004型電子分析天平 上海恒平科學(xué)儀器有限公司；RE-2000型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；SHZ-D（Ⅲ）型循環(huán)水真空泵、101B-2型電熱鼓風(fēng)干燥箱 上海申光儀器儀表有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 以甲醇為溶劑配成質(zhì)量濃度為1g/L的蘆丁對(duì)照品貯備液，使用時(shí)分別稀釋成系列濃度：0.02、0.06、0.10、0.20、0.50、1g/L。

1.2.2 色譜條件 參照彭艷芳[2]棗果蘆丁HPLC分析方法進(jìn)行，有所改動(dòng)，具體條件為流動(dòng)相及比例：甲醇/水（80∶20，v/v），流速：1.0mL/min，進(jìn)樣量：20μL，柱溫：40℃。

1.2.3 待測(cè)樣品的制備

1.2.3.1 凌棗預(yù)處理 選擇飽滿完整的凌棗分為3份，用冷水沖洗，去除凌棗表面附著的塵土、泥沙，水蒸汽蒸30min后立即放入冷水中浸泡、剝皮。凌棗果皮、果肉、果核及全棗分別于65℃電熱鼓風(fēng)干燥箱內(nèi)烘干，粉碎機(jī)粉碎，過(guò)40目篩后裝袋密封，置于干燥器中貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3.2 凌棗黃酮提取方法 準(zhǔn)確稱取干燥至恒重的棗粉1.000g置于250mL圓底燒瓶中，加入一定體積和濃度的乙醇溶液，在設(shè)定溫度恒溫水浴中加熱回流提取一定時(shí)間后抽濾，收集濾液并蒸干溶劑后，用30%乙醇溶液定容至刻度，即為待測(cè)液。

1.2.3.3 黃酮得率的計(jì)算 以提取液黃酮得率作為考查指標(biāo)，黃酮得率計(jì)算式為：S（%）=cv/m×100

式中：S—黃酮得率，mg/g；c—提取液蘆丁含量，mg/mL；v—提取液定容體積，mL；m—棗粉質(zhì)量，g。

1.2.4 還原力測(cè)定 參照Oyaizu和榮建華等的方法[3-4]。取2.0mL不同濃度的樣品（2～50mg/mL）或抗壞血酸溶液（標(biāo)準(zhǔn)參照物），加入2.0mL pH6.6的磷酸鹽緩沖液（0.2mol/L）和2.0mL 1%（w/v）的鐵氰化鉀溶液，混勻，在50℃保溫20min后迅速冷卻，向混合液中加入2.0mL 10%（w/v）的三氯乙酸溶液，混勻后以655.2×g離心10min。取上清液2.5mL，加入2.5mL蒸餾水和0.5mL 0.1%（w/v）的三氯化鐵溶液，然后在700nm波長(zhǎng)下比色，以水為空白。吸光值越大，則樣品的還原力越強(qiáng)。

1.2.5 清除羥自由基能力的測(cè)定 以鄰二氮菲-亞鐵化學(xué)法測(cè)定羥自由基能力清除能力[5]。取7.5mmol/L鄰二氮菲溶液1mL置于試管中，依次加入0.2mol/L的pH7.40磷酸緩沖液2mL和樣品液1mL，充分混合后，加入0.75mmol/L硫酸亞鐵液1mL，混勻，加入1mL 0.01% H2O2，于37℃下溫育60min，于536nm測(cè)其吸光度值，記為AS。用1mL蒸餾水代替1mL H2O2，測(cè)得的吸光度稱AB?？瞻坠芤?.00mL蒸餾水代替1.00mL樣品作為參照，測(cè)得的吸光度為AP，羥自由基清除能力按以下公式計(jì)算：

1.2.6 清除DPPH自由基能力測(cè)定 參照Suda描述的方法進(jìn)行測(cè)定[6]。利用DPPH溶液的特征紫紅色團(tuán)的吸收峰，用分光光度法測(cè)定加不同濃度的抗氧化劑或樣品后在517nm吸收的變化表示其對(duì)有機(jī)自由基的清除能力。取2.0mL水解液，加入1.0mL 0.2mol/L磷酸鹽緩沖液（pH7.0）和2.0mL 0.2mmol/L DPPH乙醇溶液，混合均勻，于室溫下暗處放置20min，然后在517nm下測(cè)定其吸光值，自由基DPPH的清除能力以清除率計(jì)算：

式中：A1—DPPH溶液+樣品溶液的吸光度；A2—DPPH溶劑+樣品溶液的吸光度；A0—DPPH溶液+樣品溶劑的吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立及凌棗黃酮的色譜分離結(jié)果

經(jīng)紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)掃描，甲醇溶液中蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品最大吸收波長(zhǎng)為360nm，因此，選擇檢測(cè)波長(zhǎng)為360nm。凌棗全棗粉中主要的黃酮類組分為蘆?。ㄒ?jiàn)圖1）[2，7]，圖2為蘆丁標(biāo)樣的液相色譜圖。由色譜工作站處理數(shù)據(jù)，以峰面積-質(zhì)量濃度作圖（圖形未給出），以蘆丁峰面積X為橫坐標(biāo)，相對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度Y（g/L）為縱坐標(biāo)，得到蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線為：Y=0.0019X-0.0031，R2=0.9995，線性區(qū)間為0.02～1.00g/L，按3倍信噪比（N/S）計(jì)算，蘆丁的檢出限為：0.23μg/L。

圖1 凌棗全棗黃酮提取液色譜圖Fig.1 Chromatogram of flavonoid extract from entire ling jujube

圖2 蘆丁標(biāo)樣色譜圖Fig.2 Chromatogram of rutin standard

2.2 凌棗黃酮提取實(shí)驗(yàn)結(jié)果

以75%的乙醇溶液作提取劑，在提取溫度65℃，提取時(shí)間1.5h，液固比30∶1（mL/g）條件下，提取不同部位凌棗黃酮并測(cè)定含量，測(cè)得結(jié)果表明凌棗去核全棗、棗肉、棗核和棗皮蘆丁含量分別為（3.60±0.32）、（3.85±0.27）、（0.40±0.05）、（3.50±0.65）mg/g，凌棗棗肉和棗皮中黃酮含量稍高于棗核，考慮去核全棗原料豐富易得，并易于處理，以下提取參數(shù)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)均以凌棗去核全棗（簡(jiǎn)稱凌棗）為原料來(lái)進(jìn)行。

2.2.1 提取劑濃度對(duì)凌棗黃酮得率的影響 固定提取溫度65℃，提取時(shí)間1.5h，液固比30∶1（mL/g），考查提取劑濃度對(duì)凌棗黃酮得率的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示，隨著乙醇濃度增大，黃酮得率增加。當(dāng)提取劑濃度為80%時(shí)提取量最大，提取效果最好，其后濃度升高，提取量反而下降。其原因可能是當(dāng)提取劑濃度超過(guò)80%時(shí)，凌棗全棗粉中一些雜質(zhì)隨之溶出，對(duì)提取過(guò)程產(chǎn)生了干擾，從而使黃酮得率下降，因此選用濃度為80%的乙醇濃度進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)。

圖3 提取劑濃度對(duì)凌棗黃酮得率的影響Fig.3 Effect of extractant concentration on ling jujube flavonoid yield

2.2.2 液固比對(duì)凌棗黃酮得率的影響 固定乙醇濃度75%，提取時(shí)間1.5h，提取溫度75℃，考查液固比對(duì)凌棗黃酮得率的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所示。凌棗黃酮得率隨液固比增加而增大，當(dāng)液固比為30∶1～50∶1（mL/g）時(shí)黃酮提取效果最好，之后黃酮得率略有降低，這是由于凌棗中黃酮含量有限，當(dāng)提取溶劑用量達(dá)到一定程度后，對(duì)黃酮的提取已基本完成，再增加溶劑用量對(duì)提取得率沒(méi)有提高，而且液固比過(guò)大增加生產(chǎn)成本，浪費(fèi)溶劑，并對(duì)后續(xù)濃縮工作帶來(lái)較多不便，因此選用液固比30∶1（mL/g）為宜。

圖4 液固比對(duì)凌棗黃酮得率的影響Fig.4 Effect of ratio of liquid to solid on ling jujube flavonoid yield

2.2.3 提取溫度對(duì)凌棗黃酮得率的影響 固定乙醇濃度75%，提取時(shí)間1.5h，液固比30∶1（mL/g），考查提取溫度對(duì)凌棗黃酮得率的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5所示。提取溫度對(duì)提取效果影響較大，隨著提取溫度的升高，凌棗黃酮得率呈逐漸上升趨勢(shì)，說(shuō)明溫度越高，黃酮在提取劑中的溶解度越大，提取效果越好，同時(shí)可初步判斷凌棗黃酮耐熱性好。75℃時(shí)黃酮得率達(dá)最大值，到85℃時(shí)略有下降，說(shuō)明凌棗黃酮提取的最適提取溫度在75℃左右。一般認(rèn)為，提取溫度是增大得率的有效方式，隨著溫度的升高，溶劑的分子運(yùn)動(dòng)速度加快，滲透、擴(kuò)散、溶解速度加快，從而使黃酮更易于從棗粉細(xì)胞轉(zhuǎn)移至提取溶劑中，但由于溫度升高會(huì)溶出較多雜質(zhì)，同樣會(huì)干擾黃酮的浸出。因此，選擇凌棗黃酮的提取溫度75℃進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)。

圖5 提取溫度對(duì)凌棗黃酮得率的影響Fig.5 Effect of extraction temperature on ling jujube flavonoid yield

2.2.4 提取時(shí)間對(duì)凌棗黃酮得率的影響 固定乙醇濃度75%，提取溫度75℃，液固比30∶1（mL/g），考查提取時(shí)間對(duì)凌棗黃酮得率的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖6所示。凌棗黃酮得率隨提取時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，提取時(shí)間為1.5h時(shí)提取效果最好，之后延長(zhǎng)提取時(shí)間，提取量增長(zhǎng)幅度平緩，說(shuō)明黃酮提取已基本完成，再延長(zhǎng)提取時(shí)間對(duì)黃酮得率沒(méi)有大的提高，較長(zhǎng)時(shí)間的提取會(huì)增加能源消耗和生產(chǎn)成本，降低制備效率，故提取時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)，因此選用提取時(shí)間為1.5h。

圖6 提取時(shí)間對(duì)凌棗黃酮得率的影響Fig.6 Effect of extraction time on ling jujube flavonoid yield

2.2.5 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以乙醇濃度、提取溫度、料液比、提取時(shí)間為考查因素，選用L9（34）正交表安排設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn)，以黃酮得率為考查指標(biāo)，并對(duì)各因素水平結(jié)果進(jìn)行極差分析，得出正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果。依據(jù)正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果，確定并驗(yàn)證最佳制備工藝條件。

正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果分析見(jiàn)表1。運(yùn)用極差進(jìn)行數(shù)據(jù)分析處理后得到結(jié)果為：RB＞RD＞RC＞RA，即影響凌棗棗肉黃酮類化合物提取效果的因素依次為：液固比＞提取時(shí)間＞提取溫度＞乙醇濃度，最佳因素水平為A1B2C2D3，即最佳工藝水平為液固比30∶1（mL/g）、提取時(shí)間2h、提取溫度75℃、乙醇濃度75%。經(jīng)驗(yàn)證，在此條件下，凌棗粉中黃酮類化合物得率為5.01mg/g。

表1 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果分析Table 1 Results of extracting orthogonal tests

2.3 抗氧化實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 還原力測(cè)定結(jié)果 還原力測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖7，凌棗黃酮提取液的還原力隨著提取液黃酮濃度的增加而增加，可以推測(cè)凌棗提取物中的具有電子供體作用的黃酮類物質(zhì)，通過(guò)提供電子而使自由基形成穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)從而終止了自由基的鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。在0.15～0.73mg/mL濃度范圍內(nèi)，凌棗不同部位黃酮還原力大小依次為：棗肉黃酮＞全棗黃酮＞棗核黃酮＞棗皮黃酮。

圖7 凌棗黃酮和維生素C的還原力測(cè)定結(jié)果Fig.7 Reducing power of ling jujube flavonoid extract and ascorbic acid

2.3.2 羥自由基清除能力 本實(shí)驗(yàn)中，羥自由基是由Fe2+和H2O2反應(yīng)而產(chǎn)生的，凌棗黃酮含有的酚羥基在反應(yīng)生成的羥自由基和氧自由基的清除作用中起著氫供體的作用，還原氧化性自由基[8-9]。羥自由基清除率測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖8，在0.29～3.50mg/mL濃度范圍內(nèi)，凌棗各部位黃酮提取液羥自由基清除能力均隨著濃度的增加而增大。凌棗不同部位黃酮清除羥自由基能力的順序依次為：棗肉黃酮＞全棗黃酮＞棗核黃酮＞棗皮黃酮。

2.3.3 DPPH自由基清除能力 DPPH清除能力測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖9，凌棗不同部位黃酮對(duì)DPPH自由基的清除能力大小依次為：棗肉黃酮＞全棗黃酮＞棗核黃酮＞棗皮黃酮，綜合以上結(jié)果，凌棗棗肉中可能含有較高活性或較高含量的活性黃酮組分。

圖8 凌棗黃酮和維生素C清除羥自由基的能力Fig.8 Hydroxyl radical scavenging activity of ling jujube flavonoid extract and ascorbic acid

圖9 凌棗黃酮和維生素C的DPPH自由基清除能力Fig.9 DPPH scavenging activity of ling jujube flavonoid extract and ascorbic acid

3 結(jié)論

對(duì)凌棗黃酮回流提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化，得到最佳工藝條件為：液固比30∶1（mL/g）、提取時(shí)間2h、提取溫度75℃、乙醇濃度75%。在此條件下，凌棗棗肉黃酮得率為5.01mg/g。凌棗不同部位黃酮還原力和羥自由基及DPPH自由基清除能力順序均為：棗肉黃酮＞全棗黃酮＞棗核黃酮＞棗皮黃酮，說(shuō)明凌棗棗肉中含有較高活性或較高含量的黃酮類物質(zhì)。

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