葡萄糖與賴氨酸美拉德反應產(chǎn)物的抗氧化性研究

趙 晶，張宏坤，馬丹雅，* ，張 嵐，徐 迪

(1.黑龍江東方學院，黑龍江哈爾濱150086;2.東北農(nóng)業(yè)大學，黑龍江哈爾濱150030)

美拉德反應(Maillard Reaction)或非酶褐變反應(non-enzymatic browning reaction)是食品中的氨基化合物(胺，氨基酸，肽和蛋白質(zhì))和羰基化合物(糖類)在食品加工和貯藏過程中發(fā)生的反應，由法國著名科學家L.C.Maillard 于1912 年發(fā)現(xiàn)的，因反應最終生成棕色物質(zhì)，故又稱為“褐變”反應。這一反應普遍存在于食品加工和貯存過程中，是加工食品(如焙烤類食品)的色澤和濃郁芳香風味的主要來源，因此在食品加工生產(chǎn)上有著比較廣泛的應用，尤其是合成食用香精，主要是利用美拉德反應制備［1］。美拉德反應產(chǎn)物除了能提供給食品特殊的氣味外，還具有抗氧化、抗誘變、抗病毒等特性［2-3］，尤其是抗氧化活性，具有取代傳統(tǒng)合成抗氧化劑的潛力，這是因為美拉德反應產(chǎn)物是食品加工和貯藏過程中自身形成的一類物質(zhì)，可以認為是天然的。本實驗采用葡萄糖與賴氨酸在一定條件下進行美拉德反應，制備美拉德反應產(chǎn)物，以美拉德反應產(chǎn)物對DPPH 自由基的清除率和超氧陰離子O2-·清除率來判斷美拉德反應產(chǎn)物的抗氧化能力，進而為新型抗氧化劑的研究與開發(fā)提供一定的理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

L-賴氨酸(分析純) 鄭州鴻祥化工有限公司;葡萄糖(分析純) 山東西王生化有限公司;鄰苯三酚(分析純)、氫氧化鈉(分析純)、碳酸氫鈉(分析純)、三氯化鐵(分析純)、鐵氰化鉀(分析純)、水楊酸(分析純) 天津科密歐;DPPH 西安沃爾森生物技術有限公司。

S54 型紫外分光光度計 上海棱光技術有限公司;DKS-11 型電熱恒溫水浴鍋 上海精密科學儀器有限公司;TDL-40B 臺式離心機 上海安亭科技儀器廠;98-1-B 型電子調(diào)溫電熱套 天津市泰斯特儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 美拉德反應產(chǎn)物的制備

1.2.1.1 不同反應時間下制備MRPs 稱取L-賴氨酸1.000g(L-賴氨酸中氨基的物質(zhì)量為0.0137mol)于平底燒瓶中，并加入150mL 蒸餾水使之完全溶解，而后加入葡萄糖4.922g(即葡萄糖中羰基的物質(zhì)量為0.0273mol)，使L-賴氨酸的氨基與葡萄糖的羰基的物質(zhì)量之比為1∶2，溶解后用0.2mol/L 的NaOH 調(diào)節(jié)pH8，在100℃下回流反應。并在0.5、1、2、4、6、8、10h 取樣，得到不同反應時間下的MRPs，放入4℃冰箱內(nèi)待測。

1.2.1.2 不同起始pH 下制備MRPs 使L-賴氨酸的氨基與葡萄糖的羰基的物質(zhì)量之比為1 ∶2。用0.2mol/L 的NaOH 調(diào)節(jié)溶液的pH 分別6、7、8、9，在100℃下回流8h 取樣。

1.2.1.3 不同反應溫度下制備MRPs 使L-賴氨酸的氨基與葡萄糖的羰基的物質(zhì)量之比為1 ∶2，調(diào)節(jié)pH9，在不同溫度下(70、80、90、100℃)回流8h 取樣。1.2.1.4 不同反應濃度下制備MRPs 稱取L-賴氨酸1.000g 4 份(L - 賴氨酸中氨基的物質(zhì)量為0.0137mol)于平底燒瓶中，并加入150mL 蒸餾水使之完全溶解，而后分別加入葡萄糖4.922、2.461、1.231、0.822g，即葡萄糖中羰基的物質(zhì)量分別為0.0273、0.0137、0.0068、0.0046mol，使L-賴氨酸的氨基與葡萄糖的羰基的物質(zhì)量之比為1 ∶2、1 ∶1、2 ∶1、3∶1。用0.2mol/L 的NaOH 調(diào)節(jié)反應溶液pH 分別為9，在溫度100℃條件下回流反應8h 后取樣。

1.2.2 對O2-·清除率的測定 將4.50mL 0.1mol/L Tris-HCl 緩沖液(pH8.2)、MRPs 樣液1mL 和蒸餾水2.4mL 混勻，25℃下保溫10min 后加入0.1mL 6mmol/L鄰苯三酚，計時，搖勻，準確反應3min 后，加入10mol/HCl 溶液0.1mL，終止反應，以蒸餾水為參比，在325nm 下測定吸光值A。清除率越大抗氧化能力越強。

清除率(%)=(A0-Ai)/A0×100

式中:A0為用水代替樣液時測得的吸光度;Ai為不同樣液測得的吸光度。

1.2.3 對DPPH·清除率的測定 取MRPs 樣液2.5mL及2 ×10-2mol/L 的DPPH 溶液2.5mL 加入同一具塞試管中搖勻，于室溫下密閉靜置30min，用無水乙醇與水混合液(體積比為1∶1)作參比，于517nm 波長處測定吸光度［4］，清除率越大抗氧化能力越強。

清除率(%)=［1-(Ai-Aj)/A0］×100

式中:A0為未加MRPs 時DPPH 溶液的吸光度;Ai為加MRPs 后DPPH 溶液的吸光度;Aj為MRPs 的吸光度。

2 結果與分析

2.1 反應時間的影響

超氧陰離子有一定的毒副作用，由多種生物反應和光化學反應產(chǎn)生，它還能分解形成更強的活性氧化物質(zhì)，如單線態(tài)氧和羥自由基，導致脂質(zhì)過氧化。鄰苯三酚在堿性條件下能迅速自氧化，釋放超氧陰離子，生成有色的產(chǎn)物。當有自由基清除劑存在時，可清除超氧陰離子，阻止有色產(chǎn)物的積累［5］。

DPPH 在有機溶劑中是一種穩(wěn)定的自由基，其結構中含有3 個苯環(huán)，氮原子上有1 個孤對電子，其乙醇溶液呈紫色，在517nm 附近有強吸收。當有自由基清除劑存在時，DPPH·的單電子由于被配對，DPPH·濃度減小而使其顏色變淺，在517nm 波長處的吸光度變小，這種顏色變淺的程度與配對電子數(shù)成化學計量關系，因而可用分光光度法進行定量分析［6］。

由圖1 結果可知，隨著反應時間的延長，MRPs對O2-·清除率在6h 前是顯著增強的，從6h 以后MRPs 對O2-·清除率有個緩慢下降的趨勢，MRPs 對O2-·清除率可能與其分子中的活性羥基和氨基有關［7］。在6h 前MRPs 分子中活性的羥基和氨基是逐漸增多的，通過6h 反應體系中的氨基與羰基進行大量縮合使體系中活性氨基明顯減少，因此對O2-·清除率也就下降了。

圖1 反應時間對MRPs 清除O 2-·和DPPH·的影響Fig.1 Effect of reaction time on MRPs scavenging ratio O 2-·and DPPH·

同時從圖1還可知，MRPs 對DPPH·的清除率是隨著反應時間的延長而越來越強的，當反應時間達到8h 時，其反應產(chǎn)物的DPPH·清除率達到最高。因美拉德反應達到一定時間，美拉德反應中間產(chǎn)物與氨基化合物進行醛基-氨基反應最終生成類黑精，其短肽含有抗氧化活性的支鏈氨基酸，而且在產(chǎn)生類黑精的同時，有一系列的美拉德反應中間體-還原酮類物質(zhì)及雜環(huán)類化合物生成，這些產(chǎn)物也具有抗氧化等活性［8］。

綜合MRPs 對兩種清除率反應時間的考慮，MRPs 對O2-·清除率在6h 達到最大，但在8h 稍微有所下降，而MRPs 對DPPH·的清除率在反應8h 已經(jīng)達到最大，所以可以認為反應8h 為較佳條件。

2.2 反應pH 的影響

樣品在反應開始時是無色的，一經(jīng)加熱后，均有從白色到淺黃色、黃色、橘色最后為褐色的不同程度的顏色漸變過程。樣品色澤的變化速率隨樣品初始pH 的增加而增加。從圖2 可知隨著反應初始pH 的增大，MRPs 對O2-·及DPPH·的清除率是逐漸增大的，即抗氧化的能力也是逐漸增強的。在pH6～7 偏酸性的環(huán)境中，無論是O2-·還是DPPH·的清除率增加得都比較平緩。而當pH7～8 偏堿性時清除率曲線的斜率很大，說明清除率增加的幅度很快，主要原因是因為氨基在較低pH 環(huán)境中質(zhì)子化，不能進行親核進攻，只有不帶電的氨基能夠與羰基縮合。所以，酸性環(huán)境中羰氨縮合速率很低。羰氨縮合后，糖通過反醇醛、烯醇化和脫水反應進行降解，這些反應都是具有堿催化作用的［9］，所以美拉德反應速率隨介質(zhì)pH 的升高而增大。本實驗選擇賴氨酸與葡萄糖為實驗材料，賴氨酸本身就是一種堿性氨基酸是有利于美拉德反應的，從圖2 也可以看出pH8～9 時MRPs對O2-·及DPPH·的清除率是平緩增加的，所以選擇初始pH9 的反應條件是比較合理的。

圖2 pH 對MRPs 清除O 2-·和DPPH·的影響Fig.2 Effect of pH on MRPs scavenging ratio O 2-·and DPPH·

2.3 反應溫度的影響

美拉德反應是十分復雜的化學過程，反應條件對MRPs 抗氧化能力的影響也越來越受到關注。美拉德反應中溫度是一個非常重要的因素，隨著反應溫度的升高，美拉德反應的速度大為加快。且溫度較高時，還可產(chǎn)生許多香味物質(zhì)，這對MRPs 的抗氧化作用是很有幫助的。

由圖3 可見，不同溫度加熱反應得到的MRPs 對O2-·和DPPH·的清除率也不同，清除率隨溫度的升高而增加，即抗氧化能力增強。70℃清除率低，100℃時清除率明顯增加，說明低于100℃時，反應溫度越高，反應越劇烈，顏色越深，MRPs 對O2-·和DPPH·清除率越大，抗氧化能力就越強。因為溫度高有利于美拉德反應，溫度越高在較短時間內(nèi)就能生成類黑精，還原酮及一系列含N、S 的雜環(huán)化合物，這些物質(zhì)都具有清除O2-·和DPPH·的能力。因而根據(jù)實驗數(shù)據(jù)和相關理論，認為反應100℃時MRPs 對O2-·和DPPH·的清除能力較好。

圖3 溫度對MRPs 清除O 2-·和DPPH·的影響Fig.3 Effect of reaction temperature on MRPs scavenging ratio O 2-·and DPPH·

2.4 反應物濃度的影響

葡萄糖和賴氨酸的不同濃度代表反應體系中羰基與氨基的比例不同。本實驗設計的氨基與羰基比例分別是1∶2、1∶1、2∶1、3∶1，由圖4 可知在氨基與羰基比例為1∶2 時，MRPs 對O2-·和DPPH·的清除能力較強，此時反應體系中氨基所占比例較小，原因可能是因為氨基的增多使分子內(nèi)氨基和羧基會失水形成內(nèi)酰胺而降低了參與美拉德反應的氨基的物質(zhì)量，使褐變速率減緩，那么MRPs 對O2-·和DPPH·清除能力就變小了，所以在氨基與羰基比為1∶2 時，為制備具有抗氧化MRPs 較佳條件之一。

圖4 反應物濃度對MRPs 清除O 2-·和DPPH·的影響Fig.4 Effect of reaction concentration on MRPs scavenging ratio O 2-·and DPPH·

3 結論

本實驗以賴氨酸和葡萄糖三種不同比例發(fā)生美拉德反應制備了其MRPs，隨反應的進行，測定在不同pH 和溫度條件下的抗氧化能力。通過單因素實驗結果分析，得出最佳反應條件是:溫度100℃，時間8h，pH9，氨基與羰基比為1∶2 時，MPRs 對O-2·清除率和DPPH·清除率可分別達到82.35%和71.12%，此時MPRs 的抗氧化能力最強。

在美拉德反應體系中，產(chǎn)物的抗氧化能力同時受多種因素控制，選擇適當?shù)姆磻獥l件可以提高MRPs 的抗氧化能力。美拉德反應產(chǎn)物具有較強的抗氧化活性，并且是食品加工和儲藏過程中自身產(chǎn)生的一類物質(zhì)，可以認為是天然的，這給尋找和應用天然抗氧化劑提供了新的思路。但因為MRPs 的具體組成、結構和性質(zhì)等依然尚未十分清楚，且對其抗氧化機理也有待于進一步研究，所以作為商業(yè)應用的MRPs 抗氧化劑的問題還有待進一步深入研究。

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