苦蕎發(fā)芽過程中不同部位的黃酮合成動態(tài)研究

王靜波，趙 鋼，趙江林，彭鐮心，鄒 亮，向達兵

（1.成都大學(xué)生物產(chǎn)業(yè)學(xué)院，四川成都610106；2.西華大學(xué)生物工程學(xué)院，四川成都610039）

蕎麥又名烏麥、三角麥、花麥，是蓼科雙子葉植物，主要栽培種有甜蕎麥（Fagopyrum esculentum，也叫普通蕎麥）和苦蕎麥（Fagopyrum tataricum，也叫韃靼蕎麥）[1]。苦蕎麥營養(yǎng)豐富，特別是含有其他糧食作物所沒有的黃酮類化合物（如蘆丁、槲皮素、山奈酚等），其營養(yǎng)價值和藥用價值遠高于甜蕎[2-3]。但是由于其籽粒中含有高活性的胰蛋白酶抑制劑和蘆丁降解酶等抗?fàn)I養(yǎng)因子以及大量的抗性淀粉和過敏原等，從而降低了苦蕎麥的營養(yǎng)價值[4-5]。已有研究表明，苦蕎經(jīng)過萌發(fā)后，營養(yǎng)價值大幅提高，胰蛋白酶抑制劑的活性降低，脂肪酸營養(yǎng)價值提高，蘆丁降解酶活性在胚為子葉完全吸收后活性消失，氨基酸更為均衡，特別是黃酮類物質(zhì)的含量有明顯的提高[6-7]?，F(xiàn)代研究證實，黃酮類物質(zhì)具有很高的食用價值和藥用價值，具有抗氧化及抗自由基、抗癌、防癌、調(diào)節(jié)心血管系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)以及護肝、抑菌、抗病毒等多種生理功能[8-9]。苦蕎喜歡涼爽而濕潤的氣候，成熟健全的苦蕎種子，在適宜的溫度、足夠的水分和充足的氧氣的條件下，即可萌發(fā)。本文研究了苦蕎在發(fā)芽過程中胚根、胚軸、子葉三個部位總黃酮含量的合成動態(tài)并對其進行分析比較，證實了苦蕎芽子葉中總黃酮含量顯著提高，為苦蕎芽深加工中原料的選擇利用提供理論依據(jù)，同時為黃酮類物質(zhì)含量高的營養(yǎng)保健產(chǎn)品的研究開發(fā)提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

苦蕎 西蕎二號，成都大學(xué)實驗田；蘆丁、槲皮素 生化試劑，中國藥品生物制品檢定所；乙腈 HPLC級；磷酸 天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；甲醇分析純。

AP-01P型真空泵 天津奧特賽恩斯儀器有限公司；DHG-9246A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海精宏實驗設(shè)備有限公司；ESJ120-4型電子分析天平 沈陽龍騰電子有限公司；KH5200DE型數(shù)控超聲波清洗器 昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司；島津LC-20A型高效液相色譜儀，島津SPD-20A型檢測器，AT-330型柱溫箱，N2000型色譜工作站 浙江大學(xué)智達信息工程有限公司；Diamonsil-C18色譜柱 規(guī)格4.6mm×250mm，5μm。

1.2 實驗方法

1.2.1 苦蕎的發(fā)芽 選擇當(dāng)年優(yōu)質(zhì)的苦蕎種子，用0.1%的高錳酸鉀溶液消毒2min，蒸餾水洗凈，分別均勻置于鋪有三層濾紙的發(fā)芽盒中，每天補充水分，在25℃，光照強度為100μmol·m-2·s-1的條件下萌發(fā)[10-11]。第3d起，每天同一時間取樣，將胚根、胚軸、子葉分類，洗凈，測定其長度以及干重。同時將樣品烘干，粉碎，備用，取樣至第11d。

1.2.2 總黃酮含量的測定 采用三氯化鋁法（在420nm處比色）測定苦蕎芽不同部位的總黃酮含量[12]。以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得到吸光值A(chǔ)與蘆丁濃度C（mg/mL）的關(guān)系曲線的回歸方程：A=33.865C-0.0203，R2=0.9987。根據(jù)回歸方程由吸光度計算出苦蕎芽不同部位提取物總黃酮含量。

1.2.3 蘆丁、槲皮素含量的測定

1.2.3.1 不同部位提取液的制備 精密稱取樣品0.1g，加入25mL、70%的甲醇溶液，55℃條件下超聲提取25min，靜置放冷，經(jīng)0.45μm微孔膜過濾，即得。

1.2.3.2 蘆丁、槲皮素含量的測定 用反向高效液相色譜法（RP-HPLC）測定不同部位中主要黃酮類物質(zhì)（蘆丁、槲皮素）的含量[13-14]。色譜條件為：色譜柱：Diamonsil-C18柱（4.6mm×250mm，5μm）；流動相：乙腈-0.2%磷酸溶液線性梯度洗脫（洗脫程序見表1）；流速：1.0mL/min；檢測波長：365nm；進樣量：20μL；柱溫30℃。

表1 梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution program

2 結(jié)果與分析

2.1 苦蕎發(fā)芽過程中不同部位長度的變化

苦蕎芽生長過程中胚根、胚軸的長度變化見圖1。

從圖1可以看出，苦蕎芽胚根和胚軸的長度，在第3～7d范圍內(nèi)，增加幅度較大；在第7～11d范圍內(nèi)，變化平穩(wěn)。同時在發(fā)芽過程中，測得胚根、胚軸的長度最大值分別為：10.20、9.70cm。

2.2 苦蕎發(fā)芽過程中不同部位干重的變化

圖1 苦蕎發(fā)芽過程中胚根、胚軸長度的變化動態(tài)Fig.1 Kinetic Studies on the length of radicle，hypocotyl during germination process

圖2 苦蕎發(fā)芽過程中不同部位干重的變化動態(tài)Fig.2 Kinetic Studies on dry weight of different parts during germination process

苦蕎芽生長過程中不同部位的干重變化見圖2。

從圖2可以看出，苦蕎發(fā)芽過程中胚根、胚軸、子葉的干重均在第3～6d范圍內(nèi)，增加幅度較大，差異性顯著（p＜0.05），在第7～11d范圍內(nèi)，變化平穩(wěn)，在第9d達到最大值?？嗍w芽胚根、胚軸、子葉的干重最大值分別為：0.15、0.28、0.33g/100株。且在發(fā)芽過程中，同一發(fā)芽時間，三個部位的干重含量存在顯著性差異（p＜0.05），且子葉的干重最大，其次是胚軸、胚根。

2.3 苦蕎發(fā)芽過程中不同部位總黃酮合成動態(tài)

按1.2.2總黃酮含量的測定方法，測定苦蕎芽發(fā)芽過程中不同部位的總黃酮含量，結(jié)果見圖3。

圖3 苦蕎發(fā)芽過程中不同部位的總黃酮合成動態(tài)Fig.3 Kinetic Studies on flavonoids of different parts during germination process

從圖3中可以看出，苦蕎發(fā)芽過程中，胚根、子葉的總黃酮含量在第3～9d范圍內(nèi)增加幅度較大，其含量存在顯著性差異（p＜0.05），增加至第9d時達到最大值，然后處于相對穩(wěn)定水平，其總黃酮含量最大值分別為2.54、87.08mg/g；苦蕎胚軸的總黃酮含量變化趨勢為：隨著發(fā)芽天數(shù)的增加，總黃酮含量降低。且在第4～10d范圍內(nèi)其含量存在顯著性差異（p＜0.05）?？嗍w發(fā)芽過程中，在同一發(fā)芽時間，總黃酮含量子葉中最高，其次是胚軸，胚根中含量最低。且在相同發(fā)芽時間，三個部位的總黃酮含量存在顯著性差異（p＜0.05）。胚根總黃酮含量的變化范圍為：1.01～2.54mg/g；胚軸總黃酮含量的變化范圍為：3.24～7.80mg/g；子葉總黃酮含量的變化范圍為：39.72～87.08mg/g。實驗測得苦蕎種子的總黃酮含量為：20.24mg/g，可見發(fā)芽后苦蕎子葉的總黃酮含量顯著提高，為種子中總黃酮含量的4.30倍。

2.4 苦蕎發(fā)芽過程中不同部位蘆丁、槲皮素的合成動態(tài)

按1.2.3蘆丁、槲皮素的測定方法，測定苦蕎發(fā)芽過程中不同部位的蘆丁、槲皮素含量，結(jié)果見圖4、圖5。

圖4 苦蕎發(fā)芽過程中不同部位的蘆丁合成動態(tài)Fig.4 Kinetic Studies on rutin of different parts during germination process

圖5 苦蕎發(fā)芽過程中不同部位的槲皮素合成動態(tài)Fig.5 Kinetic Studies on quercetin of different parts during germination process

從圖4可以看出，苦蕎發(fā)芽過程中，三個部位的蘆丁含量變化趨勢與總黃酮含量變化趨勢相同。胚根、子葉的蘆丁含量在第3～9d范圍內(nèi)增加幅度較大，其含量存在顯著性差異（p＜0.05），胚軸中的蘆丁含量在3～11d范圍內(nèi)逐漸降低，且其含量存在顯著性差異（p＜0.05）。苦蕎發(fā)芽過程中，在同一發(fā)芽時間，蘆丁含量子葉中最高，其次是胚軸，胚根中含量最低。且在相同發(fā)芽時間，第11d時，胚根、胚軸的蘆丁含量無顯著性差異（p＜0.05），其余時間三個部位的蘆丁含量存在顯著性差異（p＜0.05）。其胚根的蘆丁含量變化范圍為0.71～2.23mg/g、胚軸的蘆丁含量的變化范圍為2.54～7.02mg/g、子葉的蘆丁含量的變化范圍為35.84～84.23mg/g。

從圖5可知，胚根、子葉中的槲皮素含量在3～9d范圍內(nèi)逐漸降低，且在第4～9d范圍內(nèi)降低幅度較大，含量存在顯著性差異（p＜0.05）。第9d后處于相對穩(wěn)定水平；胚軸中的槲皮素含量逐漸升高，且其含量存在顯著性差異（p＜0.05）。苦蕎發(fā)芽過程中，在同一發(fā)芽時間，第3d時，胚軸、子葉中的槲皮素含量無顯著性差異（p＜0.05），其余時間三個部位的槲皮素含量存在顯著性差異（p＜0.05）。其胚根的槲皮素含量變化范圍為：0.29～0.68mg/g，胚軸的槲皮素含量的變化范圍為0.38～0.83mg/g，子葉槲皮素含量的變化范圍為0.15～0.37mg/g。由以上結(jié)果可知，苦蕎芽中的黃酮類物質(zhì)以蘆丁為主，因而對蘆丁的有效保持和利用具有重要的意義。

圖6 蘆丁、槲皮素的色譜圖Fig.6 HPLC profiles for rutin and quercetin analysis

苦蕎芽胚根、胚軸、子葉提取液的蘆丁、槲皮素的色譜圖以及蘆丁、槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖見圖6。

3 結(jié)論

本文對苦蕎發(fā)芽過程中不同部位的長度、干重變化以及總黃酮含量和主要黃酮類物質(zhì)蘆丁、槲皮素合成動態(tài)進行了研究。實驗結(jié)果表明，胚根、胚軸、子葉的干重均在第9d達到最大值，分別為：0.15、0.28、0.33g/100株，且在同一發(fā)芽時間，胚根、胚軸、子葉的干重，子葉中最高，胚根中最低。苦蕎發(fā)芽過程中，胚根、子葉的總黃酮含量，在第3～9d范圍內(nèi)增加幅度較大，逐漸升高至第9d時達到最大值，之后處于相對穩(wěn)定水平。其總黃酮最大值分別為2.54、87.08mg/g；苦蕎胚軸的總黃酮含量變化趨勢為：隨著發(fā)芽天數(shù)的增加，總黃酮含量降低?？嗍w發(fā)芽過程中，三個部位的蘆丁含量變化趨勢和總黃酮含量變化趨勢相同；胚根、子葉中的槲皮素含量在3～9d范圍內(nèi)逐漸降低，第9d后處于相對穩(wěn)定水平，而胚軸中的槲皮素含量逐漸升高?？嗍w芽子葉的總黃酮含量明顯高于胚根和胚軸，且其含量為苦蕎種子中總黃酮含量的4.30倍，其黃酮類物質(zhì)以蘆丁為主?？嗍w芽子葉顏色為綠色，具有清香味，感官品質(zhì)優(yōu)良，可進行進一步的深加工研究，用于制備苦蕎茶、酒等一系列保健產(chǎn)品，滿足消費者對保健產(chǎn)品越來越高的要求。因而對苦蕎子葉的有效利用具有重要的意義。

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