雙齒圍沙蠶消化道共棲微生物菌群多樣性的PCR-DGGE分析

張柏東,連彬,王斌,周一兵,何潔

(大連海洋大學(xué)遼寧省海洋生物資源恢復(fù)與生境修復(fù)重點實驗室,遼寧大連116023)

雙齒圍沙蠶消化道共棲微生物菌群多樣性的PCR-DGGE分析

張柏東,連彬,王斌,周一兵,何潔

(大連海洋大學(xué)遼寧省海洋生物資源恢復(fù)與生境修復(fù)重點實驗室,遼寧大連116023)

將采自青島市沿海潮間帶的雙齒圍沙蠶Perinereis aibuhitensis(體質(zhì)量為4～5 g)置于無菌海水中暫養(yǎng)24 h后,分別從5條雙齒圍沙蠶消化道中提取微生物基因組總DNA,應(yīng)用細(xì)菌16S rDNA通用引物341f/ 534r進(jìn)行細(xì)菌16S rDNA基因V3高變異區(qū)的PCR擴增,再將PCR產(chǎn)物進(jìn)行變性梯度凝膠電泳 (DGGE),從而獲得樣品消化道共棲微生物群落特征的DNA指紋圖譜。通過對指紋圖譜半定量分析發(fā)現(xiàn),采集的雙齒圍沙蠶消化道共棲微生物菌群多樣性豐富,優(yōu)勢條帶明顯,不同個體間既存在共同的微生物種屬,也有各自特異的種屬。其中存在一條共同的優(yōu)勢條帶,但優(yōu)勢條帶含量存在個體間差異。分別對DGGE指紋圖譜中公共條帶序列進(jìn)行測序比對,結(jié)果表明,產(chǎn)丙酸菌屬Propionigenium分別為5個樣品中的優(yōu)勢菌群,假交替單胞菌屬Pseudoalteromonas廣泛分布于雙齒圍沙蠶消化道中。研究表明,基于16S rDNA的PCRDGGE圖譜技術(shù)是分析雙齒圍沙蠶及其他海洋沉積食性無脊椎動物消化道微生物菌群結(jié)構(gòu)較為有效的手段。

雙齒圍沙蠶;消化道;微生物;PCR-DGGE技術(shù)

雙齒圍沙蠶Pernereis aibuhitensis隸屬于環(huán)節(jié)動物門、多毛綱,是重要的海洋沉積食性無脊椎動物,其遷徙距離短,在中國河口沉積物和沿海灘涂有著廣泛的地理分布[1]。雙齒圍沙蠶能夠蓄積環(huán)境中的大量有機污染物并通過自身的生物轉(zhuǎn)化作用代謝和分解污染物,沙蠶也可以改善養(yǎng)殖水體底質(zhì),修復(fù)環(huán)境,是海洋沉積環(huán)境早期污染生態(tài)風(fēng)險評價的指示生物和生態(tài)毒理學(xué)研究中重要的模式生物[2-4]。消化道微生物群落不僅是無脊椎動物正常生長代謝的重要保障,同時也與環(huán)境的變化息息相關(guān)[5-6]。目前,國內(nèi)外關(guān)于雙齒圍沙蠶消化道內(nèi)共棲微生物菌群結(jié)構(gòu)、分布特點和各種群之間關(guān)系的研究還很少,關(guān)于雙齒圍沙蠶消化道微生物的研究多集中于對蛋白酶高產(chǎn)菌株等具有生物活性菌株的分離鑒定及其酶學(xué)特性的研究[7-9]。因此,獲取更多關(guān)于雙齒圍沙蠶消化道微生物菌群結(jié)構(gòu)和分布特點的相關(guān)信息,對海洋環(huán)境的監(jiān)測和治理具有重要意義。本研究中,作者通過提取雙齒圍沙蠶消化道定植菌總菌基因組DNA,利用PCR-DGGE方法獲得消化道菌群的種類組成,為探討雙齒圍沙蠶消化道中微生物菌群的生物多樣性提供了技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

雙齒圍沙蠶采自山東青島沿海潮間帶同一灘涂區(qū)域,體質(zhì)量為4～5 g。

PCR引物由生工生物工程 (上海)股份有限公司合成;TaqDNA聚合酶和PCR反應(yīng)緩沖液購自寶生物工程 (大連)有限公司;DGGE相關(guān)試劑和GeneFinder核酸染料均購自生工生物工程 (上海)股份有限公司;細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒購自北京博凌科為生物科技有限公司。PCR儀為Eppendorf Authorized Thermal Cider;DGGE電泳儀為Bio-Rad Dcode Universal Detection System。

1.2 方法

選取健康的5條雙齒圍沙蠶置于實驗室無菌海水中暫養(yǎng)24 h,使其排出腸道內(nèi)容物。用體積分?jǐn)?shù)為10%的乙醇溶液麻醉后,將沙蠶置于超凈工作臺解剖盤中,用體積分?jǐn)?shù)為75%的乙醇消毒體表,再經(jīng)無菌水沖洗后,解剖取出沙蠶消化道樣品備用。

1.2.1 基因組DNA的提取 無菌操作提取雙齒圍沙蠶新鮮腸道樣品 (約200 mg)后,按照糞便基因組DNA快速提取試劑盒說明書進(jìn)行沙蠶消化道總菌基因組DNA的提取。提取后的DNA用15 g/L的瓊脂糖凝膠電泳檢測后,置于-20℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 基因組DNA 16S rDNA V3區(qū)的擴增 以提取的雙齒圍沙蠶消化道細(xì)菌基因組DNA為模板,進(jìn)行細(xì)菌16S rDNA V3區(qū)的PCR擴增。細(xì)菌通用引物序列為GC-341f(5＇-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGCCTACGGGAGGCAGCAG-3＇)和534r(5＇-ATTACCGCGGCTGCTGG-3＇)[10-11]。PCR反應(yīng)體系:無菌雙蒸水29.6μL,10×PCR緩沖液5μL,2.5 mmol/L dNTP 5μL,10 mmol/L PCR引物各3μL,5μg/μLTaq酶0.4μL,DNA模板3μL。試驗以分離自雙齒圍沙蠶消化道的游海假交替單胞菌純菌株作為陽性對照,以ddH2O替代樣品DNA作為陰性對照。PCR反應(yīng)程序:94℃下預(yù)變性5 min;94℃下變性30 s,53℃下退火30 s,72℃下延伸90 s,共進(jìn)行30個循環(huán),每個循環(huán)退火時間增加1 s;最后在72℃下延伸10 min。PCR產(chǎn)物用15 g/L的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測。

1.2.3 DGGE凝膠電泳及切膠的測序分析 采用Bio-Rad公司的Dcode DGGE系統(tǒng)對PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳分離。采用8%聚丙烯酰胺凝膠,變性梯度為35%～50%(100%的變性劑為100mL去離子水中含42 g尿素和40 g去離子甲酰胺),電泳緩沖液為1×TAE,在60℃、120 V條件下電泳12 h。電泳后,用Genefinder染色30 min,在超純水中脫色15 min。使用Kodak Image Station 440紫外凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行拍照。在紫外燈下,對DGGE指紋圖譜中特異性條帶進(jìn)行切膠,切下的膠溶于50μL無菌雙蒸水中過夜將DNA模板溶出,再通過不帶GC夾子的引物341f和534r對溶出模板進(jìn)行相同條件的PCR擴增,將擴增后的產(chǎn)物經(jīng)檢測后交付生工生物工程 (上海)股份有限公司進(jìn)行雙向測序,測序結(jié)果拼接后進(jìn)行比對分析。

1.2.4 DGGE指紋圖譜的分析 使用凝膠成像分析軟件Kodak MI(Kodak GL2000,USA)和Bio-Dap分析軟件,分別計算香濃-威納多樣性指數(shù)(H)、豐度(S)、均勻性指數(shù)(EH),以及各優(yōu)勢條帶所占比例,對DGGE指紋圖譜進(jìn)行半定量分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因組DNA16SrDNAV3區(qū)的擴增

分別以5條雙齒圍沙蠶消化道樣品 (S1～S5)總菌基因組DNA為模板,對16S rDNA V3區(qū)進(jìn)行擴增,PCR產(chǎn)物用10 g/L的瓊脂糖凝膠電泳檢測,發(fā)現(xiàn)均獲得了特異性擴增片段 (圖1),擴增出的條帶片段大小在230 bp左右。

圖1 16S rDNA V3區(qū)PCR擴增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖譜Fig.1 Agarose gel electrophoresis of PCR am plified product of V3 region of the 16S rDNA genes

2.2 變性梯度凝膠電泳 (DGGE)

對S1～S5樣品的16S rDNA V3區(qū)PCR擴增產(chǎn)物進(jìn)行變性梯度凝膠電泳,獲得DGGE指紋圖譜如圖2所示?？梢钥闯?S1～S5樣品的擴增條帶數(shù)分別為22、21、18、18、19,均表現(xiàn)出較高的菌群多樣性。其中條帶1～10均為5條雙齒圍沙蠶樣品的公共條帶,條帶14為S1、S2和S3號樣品的公共條帶,條帶15為S2～S5樣品的公共條帶,說明不同雙齒圍沙蠶的腸道菌群結(jié)構(gòu)有較多共同的微生物種屬,而不同沙蠶個體間也存在著各自特異的種屬,如條帶11、12、13分別為S3、S4、S2樣品的特異性種屬。同時,5個樣品中各自的優(yōu)勢條帶明顯并且一致,均為條帶4,而優(yōu)勢條帶信號強度有所不同,說明定植于雙齒圍沙蠶消化道的優(yōu)勢菌群的分布相對一致,但含量有所差異。

2.3 DGGE指紋圖譜分析

對雙齒圍沙蠶消化道共棲菌群的DGGE指紋圖譜進(jìn)行分析,結(jié)果見表1。從表1可見:5組樣品的豐度相近,但多樣性指數(shù)和均勻性指數(shù)有所差異,表現(xiàn)在S3、S4樣品的多樣性指數(shù)和均勻性指數(shù)相對較低,而S2、S5樣品的多樣性指數(shù)和均勻性指數(shù)相對較高。

表1 特征指數(shù)計算結(jié)果Tab.1 Calculated results of characteristic index

2.4 消化道共棲細(xì)菌群落組成和優(yōu)勢菌群分析

從16S rDNA V3區(qū)PCR-DGGE指紋圖譜中分別割膠回收了10個公共條帶 (圖2條帶1～10),對回收得到的序列進(jìn)行雙向測序比對分析,得到樣品的細(xì)菌群落組成,結(jié)果見表2。從表2可見,條帶4為產(chǎn)丙酸菌屬Propionigenium,分別為5個樣品的優(yōu)勢菌群,但樣品間相對含量不同。其中假交替單胞菌屬Pseudoalteromonas菌群分離比率相對較高,說明假交替單胞菌屬廣泛分布于雙齒圍沙蠶消化道中。本研究中獲得的親緣關(guān)系最近的序列大部分來自海洋環(huán)境,包括近岸海水、海洋沉積物和海洋生物,很好地反映了雙齒圍沙蠶的生活和棲息環(huán)境特點。

圖2 不同腸道樣品 (S1～S5)的DGGE指紋圖譜Fig.2 DGGE profile of different intestinal samples (S1～S5)

表2 DGGE共性條帶基因片段序列的比對結(jié)果Tab.2 Com parison of genom ic sequences in DGGE common bands by sequencing and Blast analysis

3 討論

本研究中,以雙齒圍沙蠶消化道總菌基因組DNA為模板,經(jīng)PCR反應(yīng)后獲得了5條16S rRNA基因V3區(qū)片段,瓊脂糖凝膠電泳顯示,各樣品目的擴增片斷亮度均勻一致,沒有其他非特異性條帶。通過對5條PCR產(chǎn)物片段進(jìn)行變形梯度凝膠電泳,所得5個樣品的DGGE條帶清晰可見,優(yōu)勢條帶明顯,證實通過變性梯度凝膠電泳對于雙齒圍沙蠶消化道微生物菌群分離達(dá)到了良好的效果。5個樣品含有較多的共同菌群,但個體間也存在特異的菌群,可能是沙蠶個體之間差異或空間異質(zhì)性產(chǎn)生攝食環(huán)境的細(xì)微變化造成的。其中4號條帶優(yōu)勢顯著,但不同樣品中亮度不同,說明個體間優(yōu)勢菌群的含量有所差別。沙蠶遷徙能力較弱,腸道菌群受攝食環(huán)境的影響較大[12-13],為了強化對有機物的腐化和礦化作用,沙蠶形成了適應(yīng)微生物生長繁殖的消化道環(huán)境,保持了特定微生物良好的活性和穩(wěn)定的菌群結(jié)構(gòu),從而維持了機體的正常生長代謝[14]。應(yīng)用Kodak MI軟件分析計算香濃-威納多樣性指數(shù)、豐度、均勻性指數(shù),對DGGE指紋圖譜進(jìn)行進(jìn)一步分析表明,S3、S4樣品的多樣性指數(shù)相對于S2、S5樣品較低,香農(nóng)-威納多樣性指數(shù)包含物種數(shù)和各種間個體分配的均勻性兩個成分,5個樣品的條帶數(shù)差別不大,但S3、S4樣品的均勻性指數(shù)明顯低于S2、S5樣品,造成S3、S4樣品的多樣性指數(shù)相對偏低的原因是條帶間含量分布不均勻。

對DGGE圖譜中10條公共條帶進(jìn)行測序比對后發(fā)現(xiàn),5個樣品中的優(yōu)勢菌群均為產(chǎn)丙酸菌屬,其次為假交替單胞菌屬。假交替單胞菌屬很可能作為特定環(huán)境下雙齒圍沙蠶常在的共棲異養(yǎng)菌,有助于分解代謝有機碳化合物,維持沙蠶正常的生長代謝。同時,本研究中獲得序列中親緣關(guān)系最近的序列的來源大部分為海洋環(huán)境,其中與條帶5和9最相近的序列分別分離自污損生物海綿[15]和發(fā)生水華的近岸海域,說明雙齒圍沙蠶消化道菌群的組成隨棲息環(huán)境的變化會出現(xiàn)相應(yīng)的調(diào)整和改變,因此,實時分析和監(jiān)測雙齒圍沙蠶消化道菌群結(jié)構(gòu)的組成,對于養(yǎng)殖水體和近海的水質(zhì)評價及環(huán)境監(jiān)測具有重要意義。

在對微生物菌群的分析中,傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法對于菌種有一定的選擇性[16]。研究表明,只有10% ～50%的微生物菌群是可培養(yǎng)的[17-18],因而傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法會造成樣品微生物多樣性的評價不準(zhǔn)確。PCR-DGGE技術(shù)是分析細(xì)菌群落多樣性和監(jiān)測微生物群落動態(tài)的一種重要工具,目前已成功應(yīng)用于研究包括人類腸道菌群[19]在內(nèi)的不同動物的消化道微生物生態(tài)組成[20-22],如馬悅欣等[23]曾采用此技術(shù)研究了四角蛤蜊的細(xì)菌多樣性。關(guān)于用沉積食性無脊椎動物作為環(huán)境質(zhì)量評價指示生物,探討其消化道微生物菌群與環(huán)境變化響應(yīng)關(guān)系的研究多集中于土壤無脊椎動物[6,13],而對作為海洋沉積環(huán)境質(zhì)量評價指示生物的雙齒圍沙蠶的相關(guān)研究還很少,本研究中,采用PCR-DGGE技術(shù)測定雙齒圍沙蠶消化道菌群,在一定程度上反映了其消化道常在菌的分布特點及菌群間的相對關(guān)系,而關(guān)于雙齒圍沙蠶消化道菌群隨環(huán)境污染的動態(tài)變化,還需要通過更多定量的研究手段如原位熒光雜交(FISH)和熒光實時定量PCR(Real-time PCR)進(jìn)行更深入的研究。

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PCR-DGGE analysis of immobilized microbial diversity in digestive tract of sand worm Perinereis aibuhitensis

ZHANG Bai-dong,LIAN Bin,WANG Bin,ZHOU Yi-bing,HE Jie
(Key Laboratory of Marine Bio-resources Restoration and Habitat Reparation in Liaoning Province,Dalian Ocean University,Dalian 116023,China)

The totalmicrobial genomic DNA was isolated from intestines of5 healthy sand wormPerinereis aibuhitensiswith biomass of approximately 4-5 g collected from shoreline of Qingdao(Shandong Province,China)and held in sterile seawater for 24 hours by Fecal DNA Extraction Kit.The V3 region of the 16S rRNA genes(approximately 230 bp)in the intestinalmicroorganismswas amplified with specific primers setof GC-341f/534r,and then DGGE(Denaturing gradient gel electrophoresis)of amplified products generated with GC-341f/534r primer set was performed with the Bio-Rad Dcode TM mutation detection system.The DGGE band profiles of immobilized bacteria in the digestive tract of the sand worm were finally generated,which provided a snapshot of composition and diversity of the immobilized bacterial population in the digestive tract of the sand worm.PCR-DGGE DNA profiles of the V3 region gene of16S rDNA showed similar profiles of5 selected individualworms and themaximal diversity levelswere observed.Some common and special bandswere identified among 5 samples,and three common predominant bands on the DGGE gelwere found,with different relative contents in each predominantband.The sequencing and blasts of the DGGE common bands indicate that the predominant intestinalmicroflora wasPropionigeniumin the 5 samples andPseudoalteromonaswas widely distributed in the digestive tract of the sand worm.The findings indicate that PCR-DGGE analysis is an effective technique for analysis of immobilized intestinalmicrobial diversity in the sand worm.

Perinereis aibuhitensis;digestive tract;microorganism;PCR-DGGE

Q959;S94

A

2095-1388(2013)05-0413-05

2013-02-16

國家 “863”計劃項目 (2006AA10Z410);國家海洋公益性行業(yè)科研專項 (200805069,201305002)

張柏東 (1986-),男,碩士研究生。E-mail:zhangbaidong1986@126.com

王斌(1962-),女,教授。E-mail:wangbin@dlou.edu.cn