細(xì)胞周期相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子E2F－1在結(jié)直腸癌中的表達(dá)及臨床意義＊

徐君毅 以敏 黃世鋒△

（1廣西醫(yī)科大學(xué)第四附屬醫(yī)院普外一病區(qū) 廣西柳州 545005；2廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科 廣西南寧 530021）

1986年Rovesdi［1］等在研究腺病毒感染細(xì)胞的核抽提物與腺病毒的E2啟動(dòng)子相互作用時(shí)發(fā)現(xiàn)了E2F家族的存在。E2F－1屬細(xì)胞周期相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子E2F家族成員之一，參與構(gòu)成細(xì)胞核和轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物，與調(diào)控細(xì)胞周期和腫瘤的發(fā)生發(fā)展有著緊密的聯(lián)系。為研究E2F－1在結(jié)直腸癌中的表達(dá)及臨床意義，本研究采用免疫組化和蛋白印跡技術(shù)對(duì)35例原發(fā)性結(jié)直腸癌標(biāo)本的E2F－1表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)，探討E2F－1蛋白表達(dá)與臨床病理指標(biāo)的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源 收集廣西醫(yī)科大學(xué)第四附屬醫(yī)院普外一病區(qū)2008年6月至2009年2月間經(jīng)病理確診的35例原發(fā)性結(jié)直腸癌手術(shù)切除標(biāo)本。術(shù)中標(biāo)本離體后，分別收取癌灶組織和距離癌灶邊緣5cm以上無(wú)癌浸潤(rùn)的全層腸壁組織各兩塊，分別作為腫瘤組和癌旁對(duì)照組。所有癌旁對(duì)照組標(biāo)本HE染色鏡下無(wú)癌浸潤(rùn)。液氮中速凍10min后置于－70℃冰箱保存。

1.2 主要試劑 鼠抗人E2F－1單克隆抗體由美國(guó)Santa Cruz公司提供，辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗鼠抗體、SP染色試劑盒、DAB顯色試劑盒均由北京中杉生物技術(shù)公司提供。

1.3 免疫組化 標(biāo)本經(jīng)10%中性福爾馬林固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋，切片厚度4μm。腫瘤組和癌旁對(duì)照組均經(jīng)HE染色后閱片證實(shí)。標(biāo)本常規(guī)二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化，檸檬酸緩沖液pH6.1高溫高壓抗原修復(fù)2min后，10%過(guò)氧化氫和小牛血清分別作用30min。滴加稀釋的一抗（稀釋濃度為1∶200），濕盒內(nèi)4℃孵育過(guò)夜，二抗和SP復(fù)合物孵育30min，每步驟間10%PBS洗片各3次，每次5 min。DAB顯色。蘇木素對(duì)比染色，梯度乙醇脫水，透明封片。PBS緩沖液代替一抗為陰性對(duì)照。

1.4 蛋白印跡 提取所有組織標(biāo)本核蛋白。按照BCA法進(jìn)行總蛋白定量，取50μg蛋白質(zhì)樣品加入含二巰基丙醇的上樣緩沖液，煮沸變性5min后上樣，以十二烷基硫酸鈉－聚丙烯酰胺凝膠（SDSPAGE）進(jìn)行電泳分離，電泳完畢后電轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜，5%脫脂奶粉室溫封閉2h，1∶200鼠抗人單克隆抗體室溫孵育2h，TBST搖床洗膜3次，每次10min。加入1∶1000HRP標(biāo)記的山羊抗鼠抗體室溫孵育1h，DAB試劑顯色，內(nèi)參照蛋白為β－actin。

1.5 結(jié)果分析 （1）免疫組化：E2F－1表達(dá)定位于細(xì)胞核，陽(yáng)性表現(xiàn)為棕黃色顆粒。隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野，計(jì)數(shù)1000個(gè)細(xì)胞，根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞所占比例分為4級(jí)：陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)0%～5%為陰性（－），陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)5%～25%為弱陽(yáng)性（＋），陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)25%～75%為陽(yáng)性（＋＋），陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)＞75%為強(qiáng)陽(yáng)性（＋＋＋）；陽(yáng)性表達(dá)率以（＋＋）和（＋＋＋）之和占總例數(shù)的百分比表示。（2）蛋白印跡：結(jié)果經(jīng)凝膠圖像處理系統(tǒng)分析處理，測(cè)出目的蛋白和內(nèi)參照β－actin各條帶光密度值，以目的蛋白與β－actin比值代表目的蛋白表達(dá)水平。

1.6 統(tǒng)計(jì)方法 用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料行采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)；蛋白印跡結(jié)果行配對(duì)t檢驗(yàn)，比較結(jié)直腸癌腫瘤組織和癌旁正常組織中E2F－1蛋白表達(dá)的差異，P＜0.05代表差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 腫瘤組與癌旁對(duì)照組 E2F－1的陽(yáng)性表達(dá)情況 腫瘤組與癌旁對(duì)照組E2F－1的陽(yáng)性表達(dá)率分別為60.0.%（21／35）、5.7%（2／35）。腫瘤組 E2F－1陽(yáng)性表達(dá)率明顯較癌旁對(duì)照組高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。

2.2 E2F－1表達(dá)與結(jié)直腸癌臨床病理特征的關(guān)系見(jiàn)表1。如表1顯示，E2F－1的表達(dá)情況與患者年齡、性別、分化程度及部位等因素?zé)o明顯相關(guān)性，與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期均顯著相關(guān)（P＜0.05）。

表1 E2F－1表達(dá)與結(jié)直腸癌臨床病理特征的關(guān)系

2.3 蛋白印跡結(jié)果 用凝膠成像系統(tǒng)及分析軟件進(jìn)行圖像掃描和分析，分別測(cè)得E2F－1和內(nèi)參照β－actin各條帶光密度值，以目的蛋白與β－actin比值代表其表達(dá)水平。腫瘤組與癌旁對(duì)照組平均表達(dá)水平分別為1.043±0.212和0.590±0.177。采用配對(duì)t檢驗(yàn)比較腫瘤組和癌旁對(duì)照組中E2F－1蛋白表達(dá)量的差異，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（圖1）。

圖1 E2F－1在腫瘤組織的癌旁正常組織中的表達(dá)情況N1、N2為腫瘤組，T1、T2為癌旁對(duì)照組

3 討 論

E2F－1是E2F轉(zhuǎn)錄因子家族成員之一，參與對(duì)細(xì)胞周期進(jìn)展、細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡的調(diào)控。近年多項(xiàng)研究證實(shí)，E2F－1在多種腫瘤組織或腫瘤細(xì)胞系中表達(dá)水平異常。楊志鴻等［2］研究發(fā)現(xiàn)E2F－1在肺癌組織中的陽(yáng)性率顯著高于正常肺組織。劉向真等［3］研究證實(shí)乳腺癌組織中E2F－1的表達(dá)率達(dá)60.71%，明顯高于正常乳腺組織，提示E2F－1與乳腺癌存在相關(guān)。伍宏彪等［4］的研究結(jié)果也提示E2F－1在早期胃癌中高表達(dá)，晚期胃癌的進(jìn)展可能與E2F－1表達(dá)降低有關(guān)。我們通過(guò)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，結(jié)直腸腫瘤組織中E2F－1的陽(yáng)性表達(dá)率為60.0.%（21／35），明顯高于癌旁對(duì)照組，而且E2F－1的表達(dá)異常不僅僅是陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目的變化，其蛋白表達(dá)量亦顯著增加。與結(jié)直腸癌臨床病理特征的單因素分析結(jié)果表明，E2F－1與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期具有相關(guān)性。這一結(jié)果與楊建華等［5］的實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本相近，提示E2F－1的表達(dá)水平上調(diào)與結(jié)直腸癌的進(jìn)展和預(yù)后相關(guān)。

尹永碩等［6］利用RNA干擾技術(shù)下調(diào)胃癌細(xì)胞中E2F－1的表達(dá)水平，導(dǎo)致胃癌細(xì)胞的增殖和侵襲能力明顯降低。E2F－1的功能是通過(guò)直接或間接對(duì)眾多下游靶基因的調(diào)控而實(shí)現(xiàn)的，因此，我們可以認(rèn)為E2F－1表達(dá)水平的變化最終將表現(xiàn)為其靶基因的表達(dá)水平變化，而腫瘤細(xì)胞生物學(xué)特性的變化則是這些靶基因表達(dá)變化的綜合體現(xiàn)。深入研究E2F－1與靶基因的聯(lián)系，將有利于理解其生物學(xué)功能。

［1］ Kovesdi I，Reichel R，Nevins JR.Identification of a cellular transcription factor involved in E1Atrans－activation［J］.Cell.1986，25；45（2）：219－228.

［2］ 楊志鴻，阮永華，金克煒等.E2F－1基因在肺癌中的表達(dá)及意義［J］.現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2011，11（24）：4828－4830.

［3］ 劉向真，王如美.乳腺癌組織中E2F－1和Skp2的表達(dá)及意義［J］.現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué)，2012，20（11）：2286－2288.

［4］ 伍宏彪，張鵬，李小強(qiáng)，等.胃癌組織中c－met、e2f－1和Ki－67的表達(dá)［J］.上海交通大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版），2009，29（12）：1482－1486.

［5］ 楊建華，孫冬霞，王蕾等.大腸癌中核轉(zhuǎn)錄因子E2F－1及細(xì)胞周期因子D1的表達(dá)及意義［J］.現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué)，2012，39（19）：5068－5070.

［6］ 尹永碩，肖強(qiáng)，謝玉波，等.轉(zhuǎn)錄因子E2F－1siRNA對(duì)胃癌MGC803細(xì)胞體外侵襲及增殖能力的影響［J］.癌癥，2008，（9）.2120－2124.