大鼠脊髓擠壓傷后硫酸軟骨素蛋白多糖NG2在時間和空間的變化＊

中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后，星形膠質(zhì)細(xì)胞（AST）活化，活化的AST又激活其它膠質(zhì)細(xì)胞一起形成膠質(zhì)瘢痕，以前認(rèn)為膠質(zhì)瘢痕以物理方式阻礙神經(jīng)細(xì)胞和軸突的再生，進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)硫酸軟骨素蛋白多糖（CSPGs）是瘢痕中最重要的再生抑制物之一。脊髓損傷早期神經(jīng)再生失敗的可能原因有Nogo－A、MAG及OMgp等的影響，最終誘導(dǎo)生長錐塌陷，抑制軸突再生。而CSPGs是神經(jīng)膠質(zhì)瘢痕中最重要的再生抑制物，應(yīng)用硫酸軟骨素酶（Chondroitinase ABC）直接中和CSPGs被認(rèn)為是最有希望的再生治療策略。CSPGs是一類細(xì)胞外基質(zhì)分子，主要由星行膠質(zhì)細(xì)胞（AST）產(chǎn)生。脊髓損傷局部通過免疫沉淀或原位雜交方法顯示CSPGs高表達(dá)，而且CSPGs沉積部位正是軸突停止再生的部位［1］；其次是體外多種CSPGs分子對軸突生長的抑制作用。研究表明蛋白多糖是中樞神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分，每個神經(jīng)元周圍基質(zhì)中硫酸軟骨素蛋白多糖的含量不同，提示它是調(diào)節(jié)神經(jīng)元微環(huán)境的關(guān)鍵因素［2］。以上這些實驗都說明CSPGs是一種抑制中樞神經(jīng)軸突生長的物質(zhì)。CS－56的表達(dá)反映著NG2（神經(jīng)元膠原抗原2，neuron－glial antigen 2）的水平，NG2是CSPGs的主要成分，因此也就是反映著CSPGs的抑制水平。CSPGs成員眾多，迄今已發(fā)現(xiàn)有30多種，按照蛋白質(zhì)和糖鏈組成和連接的不同，可以分為3類，我們選擇最主要的成分NG2作為研究對象。觀察大鼠脊髓擠壓傷后硫酸軟骨素蛋白多糖NG2在時間和空間的變化，現(xiàn)報道如下。

材料與方法

1 實驗動物 成年雄性Sprague－Dawley大鼠，體重200～230g（西安交通大學(xué)實驗動物中心提供）（n＝6），采用大鼠脊髓擠壓傷模型［3］，注意大鼠術(shù)后護(hù)理：每日2次擠尿，保持皮膚干燥，預(yù)防褥瘡。

2 脊髓壞死面積的測量 選取包含脊髓損傷中心在內(nèi)的矢狀位HE切片，在OlympusBX－60光學(xué)顯微鏡（Olympus，日本）的明視野下，經(jīng)4倍鏡對損傷區(qū)組織進(jìn)行觀察并采集數(shù)字化圖象，在Camera lucida（Opton，德國）顯微描繪器下將同一切片同視野壞死區(qū)的輪廓和比例尺放大描繪于A4打印紙上。隨后利用Photoshop7．0圖象處理軟件（Adobe，美國）獲得所選區(qū)面積的總像素值，計算顯微照片的標(biāo)尺長度，在照片上繪制單位面積，計算機(jī)軟件讀取其面積內(nèi)的像素值，可獲取單位面積的像素值，再乘以單位面積的實際面積，即得到壞死區(qū)的實際面積。

3 大鼠脊髓損傷區(qū)CS－56免疫熒光染色 應(yīng)用ABC法進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。切片經(jīng)空氣干燥后，入0．01mol／L的磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 7．4）清洗30 min，用含1%小牛血清白蛋白和0．3%Triton X－100的抗體稀釋液室溫下封閉2h，然后加入CS－56抗體（CS－56，1︰1000，Sigma），室溫下孵育過夜，切片經(jīng)PBS清洗后，加入生物素化的的抗山羊IgG（1︰200，Sigma）室溫下孵育3h，再經(jīng)PBS清洗后，置于ABC復(fù)合物中（1︰400，Sigma）室溫下孵育3h，經(jīng)PBS清洗后用葡萄糖－葡萄糖氧化酶－硫酸鎳銨－DAB加強(qiáng)法進(jìn)行顯色，切片在顯色液中孵育15～25min，顯色液為100ml 0．1mol／L醋酸鹽緩沖液含有70mg DAB、200mg葡萄糖、40mg NH4Cl、3g硫酸鎳銨和1mg葡萄糖氧化酶。然后在空氣中干燥，梯度酒精脫水，二甲苯透明，DPX封片，O－lympus BX－51顯微鏡下觀察照相。

結(jié) 果

1 擠壓傷后各時相點壞死區(qū)平均面積 見附表。脊髓擠壓傷后由于出血，組織壞死等原因壞死區(qū)面積逐漸增大，到72h后達(dá)到峰值。隨后由于出血吸收，壞死區(qū)面積趨于穩(wěn)定。

附表 擠壓傷后各時相點壞死區(qū)平均面積（mm2）計算結(jié)果

2 CS－56和GFAP的關(guān)系 CS－56是CSPGs的特異性標(biāo)記物。脊髓擠壓后在損傷部位即可見到CS－56免疫反應(yīng)增加，CS－56表達(dá)于24h內(nèi)開始升高，分布于星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)。到2周時明顯增多，充填于空洞腔內(nèi)。GFAP于受傷當(dāng)時主要分布于脊髓損傷的緊靠斷端附近，分布比較稀疏；24h后主要分布于損傷區(qū)的周圍，而損傷的斷端逐漸減少；48h后GFAP的“積聚”表達(dá)現(xiàn)象最為明顯；1周時GFAP的表達(dá)達(dá)到高峰，而2周時的表達(dá)呈明顯地下降趨勢。CSPGs主要集中表達(dá)于損傷中心，GFAP表達(dá)陽性產(chǎn)物則逐漸向損傷區(qū)域的邊緣集中形成星形細(xì)胞瘢痕及其界膜，在損傷區(qū)內(nèi)部少見，另可見空洞形成。（見圖1、圖2、圖3）。

圖1 擠壓傷后損傷區(qū)GFAP－CS56染色后的情況

討 論

圖2 72h后損傷區(qū)周圍GFAP－CS56表達(dá)

圖3 損傷2周時GFAP－CS56表達(dá)

脊髓損傷（SCI）后再生修復(fù)能力有限與受傷時的機(jī)械性因素和傷后所產(chǎn)生的化學(xué)性因素有關(guān)，前者是指傷后局部膠質(zhì)瘢痕的空間阻礙，機(jī)械性損傷因素可認(rèn)為是脊髓的原發(fā)性損傷，對于嚴(yán)重的損傷，這一病理過程是無法控制且不能選擇的。而化學(xué)性因素所導(dǎo)致的繼發(fā)性損傷此時就決定著預(yù)后情況，但這一過程確實可以通過一系列的治療措施加以糾正，至少可以阻斷病理過程的進(jìn)一步演進(jìn)。所以應(yīng)該把脊髓損傷的治療重點放在對繼發(fā)性損傷的控制上來。目前認(rèn)為，中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）抑制因子對SCI后再生修復(fù)有顯著的抑制作用，而主要的抑制因子有髓鞘結(jié)合分子（Nogo－A）、髓鞘糖蛋白（MAG）和細(xì)胞外基質(zhì)等。硫酸軟骨素蛋白多糖（CSPGs）的抑制作用更為明顯，故被作為本實驗的研究對象。各種CSPGs中，NG2，Versican，Neurocan，Brevican，Phosphacan在SCI后的表達(dá)并 不 一 致。Leonard 等［4］認(rèn) 為，NG2 是 主 要 的CSPGs，其由少突神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞前體表達(dá)。SCI后CSPGs表現(xiàn)出強(qiáng)大的抑制作用，具體表現(xiàn)為抑制軸突和神經(jīng)細(xì)胞的再生修復(fù)［5］。Davies等［6］發(fā)現(xiàn)將周圍神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元植入大鼠的脊髓后能夠再生，但再生的軸突到達(dá)硫酸軟骨素蛋白多糖豐富的損傷區(qū)后就停滯不前。這表明，硫酸軟骨素蛋白多糖對中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后的軸突再生有相當(dāng)?shù)囊种谱饔谩?/p>

因此了解脊髓損傷后CSPGs的時空分布變化，有助于理解脊髓損傷后軸突不能再生的機(jī)制，根據(jù)CSPGs的時程變化可制定針對于CSPGs的治療，并評估治療的結(jié)果。研究表明神經(jīng)突起的生長會避開CSPGs，從而CSPGs起到引導(dǎo)突起生長的作用［7－8］。隨著星形膠質(zhì)細(xì)胞的反應(yīng)性增生，膠質(zhì)瘢痕及損傷區(qū)域空洞的形成，損傷區(qū)被包裹局限，在損傷中心區(qū)域，CSPGs有大量積累，而在離損傷區(qū)較遠(yuǎn)區(qū)域表達(dá)逐漸降低。

本實驗結(jié)果顯示，NG2在SCI后24h內(nèi)開始上升，1周達(dá)到高峰，后繼續(xù)維持這種高水平的表達(dá)至傷后2周。NG2通常與細(xì)胞表面相結(jié)合，體外可表達(dá)于少突膠質(zhì)細(xì)胞和纖維型星形膠質(zhì)細(xì)胞表面。CSPGs被發(fā)現(xiàn)可以抑制層粘連蛋白（Laminin）的促進(jìn)軸突生長的特性。免疫熒光染色結(jié)果顯示，CS－56表達(dá)于24h內(nèi)開始升高，3d后CS－56呈環(huán)狀分布于損傷區(qū)周圍，GFAP有少量表達(dá)。1周時空洞逐漸出現(xiàn)，GFAP的表達(dá)集中于損傷的遠(yuǎn)近端，CS－56的表達(dá)逐漸增強(qiáng)，2周時空洞輪廓明顯，CS－56充填于空洞腔內(nèi)，而此時GFAP的表達(dá)有所下降。

CS－56的表達(dá)反映著NG2的水平，也就是反映著CSPGs的抑制水平。中樞神經(jīng)系統(tǒng)的細(xì)胞基質(zhì)中，不僅存在著能促進(jìn)神經(jīng)元生長、存活和影響可塑性的神經(jīng)營養(yǎng)因子，還存在著許多抑制神經(jīng)細(xì)胞生存、生長和修復(fù)的抑制因子。新近的研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞外基質(zhì)中還有對神經(jīng)元分化、再生過程既有促進(jìn)作用，又有抑制作用的蛋白多糖，其中CSPGs被認(rèn)為具有這種作用［7］。而研究CS－56的時間和空間分布對于有針對性脊髓繼發(fā)性損傷的治療具有指導(dǎo)作用，比如本實驗所顯示的在損傷后1周時其表達(dá)逐漸開始增強(qiáng)，這就可以確定治療的時間窗問題?；瘜W(xué)性屏障的作用在脊髓損傷的發(fā)生機(jī)理中占有關(guān)鍵位置，將治療重點置于此才可能在治療方法的組合上有新的進(jìn)展。

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