老年患者白假絲酵母菌基因分型與藥敏試驗(yàn)分析

吉地阿依，丁顯平

（1.四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院生物資源與生態(tài)環(huán)境教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室遺傳醫(yī)學(xué)研究所，成都 610064；2.四川省第五人民醫(yī)院，四川省老年病研究所，成都 610041）

真菌在自然界中分布廣泛，常以寄居和腐生方式生活，屬于條件致病菌。近年來由于濫用廣譜抗生素、大量使用免疫抑制劑以及廣泛運(yùn)用侵入性技術(shù)等原因?qū)е屡R床標(biāo)本中酵母樣真菌的分離率顯著增加［1］。白假絲酵母菌是醫(yī)院內(nèi)感染的重要病原菌，占臨床真菌感染的70%～90%［2，3］，且感染致死率高達(dá)40%［4］。本研究收集從臨床標(biāo)本中分離并鑒定的320株白假絲酵母菌，用PCR方法擴(kuò)增其25SrDNA基因的內(nèi)含子區(qū)，根據(jù)可轉(zhuǎn)座I型內(nèi)含子插入片段的數(shù)目及大小對白假絲酵母菌進(jìn)行分型，并對不同基因型白假絲酵母的耐藥性進(jìn)行分析。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源 2009年1月～2012年1月四川省第五人民醫(yī)院（四川省老年病醫(yī)院）臨床微生物實(shí)驗(yàn)室分離的320株白假絲酵母菌，分別來源于男性201例，女性119例，平均年齡≥65歲。菌株主要來自痰標(biāo)本（88.13%），其余為咽拭子、大便、血液、尿液、傷口分泌物、穿刺液等標(biāo)本。所有自假絲酵母菌均經(jīng)革蘭氏染色鏡檢確認(rèn)，用VITEK 2－Compact全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)YST鑒定卡進(jìn)行鑒定。標(biāo)準(zhǔn)菌株：白假絲酵母菌ATCC 90028。

1.1.2 主要試劑 法國生物梅里埃YST酵母菌鑒定卡、法國生物梅里埃ATB Fungus 3真菌藥敏試條、上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成的引物［序列為：INT－L（5′－ATAAGGGAAGTCGGCAAAAT AGATCCGTAA－3′）和 INT－R（5′－CCTTGGCTG TGGTTTCGCTAGATAGTAGAT－3′）］、瓷珠保存管、Taq DNA 聚 合 酶、dNTPs、MgCl2、及 DNA Ladder Marker。

1.1.3 主要儀器設(shè)備 VITEK 2－Compact全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)、PCR基因擴(kuò)增儀和電泳儀。

1.2 方法

1.2.1 白假絲酵母菌的鑒定 臨床送檢的培養(yǎng)標(biāo)本經(jīng)過培養(yǎng)后生長出的疑似酵母樣真菌菌落，經(jīng)革蘭氏染色鏡檢確認(rèn)為革蘭陽性酵母樣真菌，用法國生物梅里埃VITEK 2－Compact全自動(dòng)微生物分析儀所配套的YST酵母菌鑒定卡進(jìn)行鑒定，確認(rèn)為白假絲酵母菌。

1.2.2 白假絲酵母菌的保存 用接種環(huán)挑取幾顆經(jīng)18～24h培養(yǎng)后得到的白假絲酵母菌菌落（接種于瓷珠保存管的凍存液中），擰緊瓶蓋，來回顛倒混勻，使細(xì)菌得以乳化，配成的菌懸液濁度要求為3～4個(gè)麥?zhǔn)媳葷釂挝?；用無菌移液器盡可能吸出凍存管中的菌懸液，將瓷珠存放于－20℃的冰箱中備用。1.2.3 白假絲酵母菌的DNA制備 從瓷珠保存管中取出瓷珠，將白假絲酵母菌菌株直接接種于酵母浸出粉－胰蛋白胨－右旋葡萄糖（YEPD）平板上，在35℃孵育箱中培養(yǎng)24～48h，待生長出單個(gè)的純菌落。取1個(gè)純菌落加入到500μL的原生質(zhì)體緩沖液中，原生質(zhì)體緩沖液成分為1mmol／L山梨醇、0.25mg溶菌酶、1%β－巰基乙醇、0.25mg溶酵母菌酶，充分振蕩混勻后放入35℃水浴箱中反應(yīng)2h，50 000r／min離心5min，取沉淀加入0.5mL裂解液，65℃水浴1h，按酚／氯仿／異戊醇法抽提出白假絲酵母菌的DNA備用。

1.2.4 PCR擴(kuò)增 M為DL2000分子量標(biāo)準(zhǔn)，9為A型白假絲酵母菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC90028，1～8為實(shí)驗(yàn)白假絲酵母菌PCR擴(kuò)增所用特異性的引物，是針對白假絲酵母菌25SrDNA編碼區(qū)可轉(zhuǎn)座I型內(nèi)含子而設(shè)計(jì)，反應(yīng)總體積為30μL的反應(yīng)體系中包含 PCR 緩 沖 液、INT－L、INT－R、Taq DNA 酶、dNTPs和 Mgcl2。反應(yīng)過程為：預(yù)變性94℃5 min，變性94℃1min，退火56℃1min，延伸72℃2min，重復(fù)30個(gè)循環(huán)后，重復(fù)延伸72℃7min。反應(yīng)結(jié)束后，所有的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物放于1.5%瓊脂糖凝膠中電泳。根據(jù)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的大小和條帶數(shù)目確定基因型，一條450bp帶為A型，一條840bp帶為B型，一條450bp帶加一條840bp帶為C型。

圖1 部分白假絲酵母菌基因分型結(jié)果

1.2.5 白假絲酵母菌的藥物敏感性分析 采用法國梅里埃公司的ATB Fungus 3真菌藥敏試劑盒，按板條操作說明進(jìn)行，根據(jù)美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會（NCCLS）頒布的 M27－A準(zhǔn)則進(jìn)行結(jié)果判定。實(shí)驗(yàn)同時(shí)用白假絲酵母菌ATCC 90028做質(zhì)控?？拐婢幬锇▋尚悦顾谺、氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑和5－氟胞嘧啶。

2 結(jié)果

2.1 320株白假絲酵母菌的分布

從臨床標(biāo)本中分離出320株白假絲酵母菌，分別為痰標(biāo)本282株（88.13%），咽拭子11株（3.44%），尿8株（2.50%），便15株（4.69%），分泌物3株（0.94%），穿刺液1株（0.31%）。

2.2 320株白假絲酵母菌的基因分型

根據(jù)電泳圖譜（見圖1），320株白假絲酵母菌分為3種基因型，包括A型201株（62.81%），B型95株（29.69%），C型24株（7.5%），未分離到D型和E型。

2.3 不同基因型白假絲酵母菌的藥敏試驗(yàn)結(jié)果分析

白假絲酵母菌A、B、C 3種基因型對主要抗真菌藥物的藥敏結(jié)果分析（見表1）。本實(shí)驗(yàn)顯示白假絲酵母菌A型對5－氟胞嘧啶耐藥率高于B型和C型；C型對兩性霉素全都敏感，敏感率高于A型和B型；C型對氟康唑、伊曲康唑的耐藥率高于A型和B型；B型對伏立康唑耐藥率高于A型和C型。

3 討論

伴隨臨床廣譜抗生素和抗真菌藥物的大量使用，真菌已成為醫(yī)院感染的重要病原菌之一。由于傳統(tǒng)的分型方法所能鑒定的真菌種類有限，且無法進(jìn)行種類的分型鑒定，嚴(yán)重影響對真菌感染的及時(shí)診斷和早期治療。因此，尋求其他方法從分子水平進(jìn)行種間及種內(nèi)的分型是真菌臨床研究及治療急需解決的關(guān)鍵問題。如何能夠及時(shí)、準(zhǔn)確地診斷真菌病是降低患者病死率的關(guān)鍵所在。利用分子生物學(xué)的方法開展深部真菌病診斷和分型研究，對指導(dǎo)臨床正確、有效地用藥有極為重要的意義。常用的白假絲酵母菌的基因分型方法主要有脈沖電泳核型－PFGE、限制性片段長度多態(tài)－RFLP、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA－RAPD、擴(kuò)增片段長度多態(tài)性－AFLP、DNA指紋、核酸序列測定及微衛(wèi)星多態(tài)性和基因芯片等。

表1 A、B、C型白假絲酵母菌藥敏結(jié)果（%）

真菌的線粒體有自己獨(dú)立的DNA和核糖體。核糖體又稱為核蛋白體，是蛋白質(zhì)合成的場所，核糖體內(nèi)包含有RNA和蛋白質(zhì)，真菌細(xì)胞中有兩種核糖體，分別是細(xì)胞質(zhì)核糖體和線粒體核糖體。細(xì)胞質(zhì)核糖體常呈游離狀態(tài)，其中的RNA根據(jù)沉降系數(shù)的不同可分為：25SRNA、18SRNA、5SRNA分子等。

白假絲酵母菌在25SrDNA編碼區(qū)內(nèi)存在一個(gè)可轉(zhuǎn)座I型內(nèi)含子，其中的3個(gè)插入片段分別為252 bp、341bp、379bp，形成的可轉(zhuǎn)座I型內(nèi)含子分為：379bp（插入379bp）、621bp（插入379bp和252 bp）、962bp（插入379bp、252bp和341bp）。有研究［5，6］報(bào)道，白假絲酵母菌基因組內(nèi)高度保守的25S rDNA基因序列，可設(shè)計(jì)成特異的引物，用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)進(jìn)行真菌特異性的擴(kuò)增，通過觀察電泳圖譜上的條帶即可將白假絲酵母菌分成5種基因型：A型（一條450bp帶）、B型（一條840bp帶）、C型（一條450bp帶加一條840bp帶）、D型（一條1 080bp帶）、E型（一條1 400bp帶）。本研究采用PCR方法擴(kuò)增白假絲酵母菌的25SrDNA基因的內(nèi)含子區(qū)進(jìn)行基因分型。臨床分離的320株白假絲酵母菌被分成A型180株，B型95株，C型45株，未分離到D和E型，結(jié)果與She等［7］一致。

本實(shí)驗(yàn)所用320株白假絲酵母菌全部分離自四川省老年病醫(yī)院入院的慢性阻塞性肺炎患者，菌株主要來源于痰標(biāo)本，占到了88.13%。患者平均年齡＞65歲，常伴有一種或多種基礎(chǔ)疾病，且大多在白假絲酵母菌感染之前都使用過抗生素或有過侵入性操作。COPD患者長期大劑量接受抗生素治療，使自身正常菌群受到破壞，呼吸道防御功能的減弱以及臨床侵襲性的操作等都給真菌的入侵創(chuàng)造了好的條件。COPD伴真菌感染臨床病死率相對普通的COPD患者較高，主要通過病史、臨床癥狀、影像學(xué)檢查以及實(shí)驗(yàn)室檢查等進(jìn)行。通過藥敏實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：沒有內(nèi)含子的A型對5－氟胞嘧啶耐藥率高于含有內(nèi)含子的B型和C型，這或許與25SrDNA中I型內(nèi)含子的存在會降低白假絲酵母菌對5－FC的耐藥性有關(guān)；C型未出現(xiàn)對兩性霉素耐藥菌株，敏感率高于A型和B型；C型對氟康唑、伊曲康唑的耐藥率高于A型和B型；B型對伏立康唑耐藥率高于A型和C型。

白假絲酵母菌是人類最重要的條件致病性真菌，用PCR分型的方法對其分型，快速、簡便、重復(fù)性好。了解不同基因型別的白假絲酵母菌耐藥情況，有助于發(fā)現(xiàn)易感菌株和易感基因，對研究真菌感染情況、指導(dǎo)臨床用藥有重要的指導(dǎo)意義，對白假絲酵母菌的流行病學(xué)研究有重要價(jià)值。

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