慢性睡眠剝奪對(duì)CAS大鼠冠狀動(dòng)脈狹窄程度的影響

彭貴海，黃琪，陳玲玲，張雨馨，王治校，譚利＊

（1.湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬太和醫(yī)院心內(nèi)科，十堰 442000；2.湖北醫(yī)藥學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，十堰 442000）

睡眠是人類(lèi)生命活動(dòng)的重要組成部分，對(duì)維持個(gè)體生存和正常心理、生理節(jié)律起著至關(guān)重要的作用。慢性睡眠剝奪（chronic sleep deprivation，CSD）指每日睡眠＜5h，持續(xù)3個(gè)月以上。CSD既是一種慢性應(yīng)激，也是一種氧化應(yīng)激，它已成為一個(gè)突出的醫(yī)療和公共衛(wèi)生問(wèn)題［1，2］。冠狀動(dòng)脈粥樣硬化（coronary atherosclerosis，CAS）是一個(gè)動(dòng)態(tài)發(fā)展的病理過(guò)程，主要表現(xiàn)為冠狀動(dòng)脈及其分支內(nèi)膜類(lèi)脂質(zhì)沉著、復(fù)合糖類(lèi)積聚，繼而出現(xiàn)纖維組織增生、鈣沉著和動(dòng)脈中層病變，以及管腔逐漸狹窄。CSD、CAS的研究較多，但將兩者結(jié)合起來(lái)研究的文獻(xiàn)［3，4］甚少。本實(shí)驗(yàn)利用CSD對(duì)CAS模型大鼠實(shí)施應(yīng)激，探討CSD對(duì)CAS大鼠冠狀動(dòng)脈狹窄進(jìn)展程度的影響及其可能機(jī)制，為臨床防治冠心病提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與試劑

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康Sprage－Dawley（SD）大鼠96只，SPF級(jí)，3～4月齡，體質(zhì)量210～260g，雌雄各半，由湖北醫(yī)藥學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心［許可證號(hào)：SCXK（鄂）2005－0008］提供。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 Vit D3注射液購(gòu)自上海通用藥業(yè)股份有限公司，膽固醇購(gòu)自成都科龍化工試劑廠，豬膽鹽購(gòu)自廣州環(huán)凱微生物有限公司，丙基硫氧嘧啶片購(gòu)自南通精華制藥有限公司，豬油自制。白細(xì)胞介素－1β（Interleukin－1β，IL－1β）試劑盒、白細(xì)胞介素－6（Interleukin－6，IL－6）試劑盒購(gòu)自武漢博士德生物化學(xué)技術(shù)公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為4組，正常對(duì)照組24只，CSD組24只，CAS模型組24只，CAS合并CSD組24只。4組實(shí)驗(yàn)環(huán)境相同，單籠喂養(yǎng)，予燈光模擬黑夜和白天，給予燈光12h／d，在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始后有1w的適應(yīng)期，均給予正常喂食，讓動(dòng)物熟悉環(huán)境。

1.2.2 CAS動(dòng)物模型制備［5］CAS組和 CAS合并CSD組喂飼高膽固醇飼料（4%膽固醇、10%豬油、5%白糖、0.5%膽酸鈉、0.2%丙基硫氧嘧啶、80.3%基礎(chǔ)飼料），并在飼養(yǎng)開(kāi)始時(shí)，腹腔注射VitD32 mL／kg（60萬(wàn)IU／kg）。12w 后，隨機(jī)抽取10%大鼠，取冠狀動(dòng)脈做病理切片，蘇木素－伊紅（HE）染色；光鏡下觀察，有80%大鼠出現(xiàn)典型動(dòng)脈粥樣硬化斑塊，即表明CAS大鼠模型建立成功。

1.2.3 睡眠剝奪實(shí)施［1，2］利用小平臺(tái)水環(huán)境法，對(duì)CSD組和CAS合并CSD組大鼠進(jìn)行睡眠剝奪。制作30cm×30cm×30cm睡眠剝奪箱，內(nèi)置一直徑為6cm的小平臺(tái)，小平臺(tái)周邊注滿(mǎn)水（水溫維持在24℃左右），水面距平臺(tái)面約1cm；于小平臺(tái)上方14cm處放置籠蓋，上面放置水和食物；大鼠在小平臺(tái)上可以自由飼食飲水，但只能在小平臺(tái)上屈曲而立；若睡眠則因伴隨全身肌肉松弛和節(jié)律性垂頭，大鼠落入水中而驚醒，再爬上站臺(tái)。用此方法，1d實(shí)施20h、持續(xù)剝奪大鼠睡眠12w。與此同時(shí)，為排除隔離、限制活動(dòng)和水環(huán)境造成的應(yīng)激影響，我們?yōu)檎?duì)照組、CAS模型組設(shè)立了大平臺(tái)，其直徑為18cm，大鼠在平臺(tái)上可以睡眠，其他環(huán)境與CSD組和CAS合并CSD組相同。每天換水并打掃實(shí)驗(yàn)箱。

1.3 檢測(cè)指標(biāo)與方法

1.3.1 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)（open field test，OFT）［4］睡眠剝奪12w后，實(shí)施OFT，觀察4組大鼠跨格次數(shù)（三爪以上跨入鄰格的次數(shù)）、直立次數(shù)（兩前肢離地1cm以上的次數(shù)或理毛的次數(shù)）以及排便量（以曠場(chǎng)試驗(yàn)結(jié)束后排便的顆粒數(shù)來(lái)表示）。

1.3.2 檢測(cè)血清致炎因子 睡眠剝奪12w后，將4組大鼠麻醉，開(kāi)胸于右心室，插管取血6mL，放入預(yù)先加入抗氧化劑的試管中，搖勻，靜置30min后，3 000rpm離心10min（SIGMA離心機(jī)，離心半徑13.5cm，1 358.37g），取血清，放入－20℃冰箱保存待測(cè)。采用放射免疫法、GC－1500型γ放射免疫計(jì)數(shù)器以及相關(guān)試劑盒檢測(cè)血清致炎因子，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明操作。

1.3.3 病理學(xué)檢查 睡眠剝奪12w后，取4組大鼠冠狀動(dòng)脈做病理切片，HE染色，觀察典型動(dòng)脈粥樣硬化斑塊以及管腔狹窄程度的變化。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，計(jì)量資料統(tǒng)計(jì)描述用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用t檢驗(yàn)處理或進(jìn)行方差分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α＝0.05。

2 結(jié)果

2.1 4組大鼠在OFT中情感行為變化

與正常對(duì)照組比較，CAS模型組跨格次數(shù)、直立次數(shù)及糞便粒數(shù)明顯增多（P＜0.05）；與CAS模型組比較，CAS合并CSD組亦明顯增多（P＜0.05）；CSD組多于正常對(duì)照組，少于CAS模型組（P＜0.05）（見(jiàn)表1）。

表1 4組大鼠曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)得分比較（±s）

表1 4組大鼠曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)得分比較（±s）

與CAS模型組比較，＊P＜0.05

?

2.2 4組大鼠血清致炎因子檢測(cè)結(jié)果

與正常對(duì)照組比較，CAS模型組IL－1β（ng／L）、IL－6（pg／mL）水平明顯增高（P＜0.05）；與CAS模型組比較，CAS合并CSD組亦明顯增高（P＜0.05）；CSD組高于正常對(duì)照組，低于CAS模型組（P＜0.05）（見(jiàn)表2）。

表2 4組大鼠血清致炎因子水平比較（±s）

表2 4組大鼠血清致炎因子水平比較（±s）

與CAS模型組比較，＊P＜0.05

?

2.3 4組大鼠病理學(xué)檢查結(jié)果

與正常對(duì)照組比較，CAS模型組CAS斑塊出現(xiàn)率、冠狀動(dòng)脈狹窄程度明顯升高（P＜0.01）；與CAS模型組比較，CAS合并CSD組亦明顯升高（P＜0.05）；CSD組高于正常對(duì)照組，低于CAS模型組（P＜0.05）（見(jiàn)表3）。

3 討論

CHD是一種生活方式病，其發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸與其個(gè)體的生活習(xí)性密切相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，與CAS模型組比較，CAS合并CSD組跨格次數(shù)、直立次數(shù)及糞便粒數(shù)明顯增多。這一結(jié)果說(shuō)明CAS模型組大鼠處于較高狀態(tài)的焦慮水平，CSD進(jìn)一步加重了CAS大鼠的焦慮行為。

表3 4組大鼠病理學(xué)檢查結(jié)果比較（±s）

表3 4組大鼠病理學(xué)檢查結(jié)果比較（±s）

與CAS模型組比較，＊P＜0.05

?

本研究結(jié)果顯示，CAS合并CSD組IL－1β、IL－6水平明顯高于CAS模型組。此結(jié)果表明CAS模型組大鼠血清IL－1β、IL－6水平較高，CSD應(yīng)激進(jìn)一步促進(jìn)血清IL－1β、IL－6濃度升高。血清IL－1β、IL－6水平升高，可能通過(guò)以下途徑參與冠心病的發(fā)生發(fā)展［6］：1）刺激其他粘附分子（如ICAM－1、VCAM－1）及其它細(xì)胞因子的表達(dá)，促進(jìn)炎癥反應(yīng)；2）刺激肝臟產(chǎn)生CRP急性炎癥因子，促進(jìn)血栓形成；3）以自分泌的方式刺激血管平滑肌細(xì)胞增生；4）炎癥反應(yīng)發(fā)生時(shí)，促進(jìn)巨噬細(xì)胞表面低密度脂蛋白膽固醇（LDL）受體的合成及巨噬細(xì)胞對(duì)LDL的作用，從而加速脂質(zhì)的沉積及粥樣硬化斑塊的形成等。IL－1β、IL－6是主要的致炎刺激因子，是心血管疾病的重要危險(xiǎn)因素，在心血管疾病的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)測(cè)方面具有重要意義［7］。

本研究病理學(xué)檢查結(jié)果顯示，CAS合并CSD組CAS斑塊出現(xiàn)率、冠狀動(dòng)脈平均狹窄程度明顯高于CAS模型組。因此，CSD可以通過(guò)刺激大鼠焦慮狀態(tài)、致炎因子的產(chǎn)生促進(jìn)CAS斑塊形成，從而加快冠狀動(dòng)脈狹窄進(jìn)展程度，提示我們要把“穩(wěn)定患者正常睡眠”作為冠心病防治的常規(guī)手段來(lái)實(shí)施［8］。

［1］李娜，趙興蓉，龔雪梅，等.慢性應(yīng)激對(duì)大鼠冠狀動(dòng)脈粥樣硬化病變及相關(guān)因素的影響［J］.中國(guó)動(dòng)脈硬化雜志，2008，16（6）：449－452.

［2］徐鋒，李結(jié)華，唐海沁，等.冠心病患者抑郁焦慮狀況及治療進(jìn)展［J］.臨床醫(yī)學(xué)，2012，32（6）：110－112.

［3］藥紅梅，呂吉元.PM2.5不同成分致冠狀動(dòng)脈粥樣硬化大鼠炎癥作用的探討［J］.環(huán)境與職業(yè)醫(yī)學(xué)，2010，27（11）：673－676.

［4］李志尚，潘宗奇，陳伯鈞，等.焦慮情緒大鼠血脂水平分析［J］.廣東醫(yī)學(xué)，2010，31（10）：1251－1253.

［5］陳長(zhǎng)香，李建民，李淑杏，等.睡眠剝奪對(duì)大鼠海馬區(qū)c－fos和IL－1β表達(dá)影響［J］.中國(guó)公共衛(wèi)生，2011，27（10）：1314－1315.

［6］張亞晶.睡眠剝奪對(duì)大鼠心臟的影響及其機(jī)制研究［D］.北京：軍醫(yī)進(jìn)修學(xué)院，2009.

［7］方舟.睡眠剝奪對(duì)心臟部分功能的影響和機(jī)制研究及其藥物干預(yù)［D］.北京：軍醫(yī)進(jìn)修學(xué)院，2011.

［8］白婧.部隊(duì)?wèi)?zhàn)士24小時(shí)睡眠剝奪后心率變異、血壓及血清內(nèi)分泌激素水平變化［D］.北京：軍醫(yī)進(jìn)修學(xué)院，2012.