幽門螺桿菌雙基因多表位重組原核表達(dá)工程菌的構(gòu)建及其表達(dá)特性的研究

楊靖，潘興，歐琴，周法庭，李建春，祝捷，周永君，李明遠(yuǎn)，王保寧△

（1.四川大學(xué)華西基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)教研室，成都 610041；2.四川萬可泰生物技術(shù)有限責(zé)任公司，成都 610041；3.湖北醫(yī)藥學(xué)院微生物學(xué)教研室，十堰 442000）

幽門螺桿菌（H.pylori）已被WHO定為第I類生物致癌因子，有大量研究［1，2］證實(shí)幽門螺桿菌感染與急慢性胃炎、胃十二指腸潰瘍、胃癌及胃粘膜相關(guān)淋巴瘤（MALT）等疾病密切相關(guān)。幽門螺桿菌感染多發(fā)生于發(fā)展中國(guó)家和第三世界，據(jù)胡伏蓮等［3］報(bào)道，我國(guó)20個(gè)省市幽門螺桿菌的感染率為42%～90%［3］。幽門螺桿菌感染會(huì)加重其他細(xì)菌和病毒腸道疾病［4］。目前臨床上常采用三聯(lián)或者四聯(lián)方法治療幽門螺桿菌感染，但治療方法復(fù)雜，存在病人依從性差和費(fèi)用昂貴等問題，使幽門螺桿菌易產(chǎn)生耐藥性［5，6］，難以達(dá)到根治目的。減毒或滅活幽門螺桿菌疫苗雖成功誘導(dǎo)機(jī)體黏膜免疫，但易產(chǎn)生發(fā)熱、嘔吐、腹瀉等不良反應(yīng)［7］，重組幽門螺桿菌疫苗由于具有免疫效果好、危險(xiǎn)性低、免疫持久等優(yōu)勢(shì)，顯示出良好的研究前景。

隨著對(duì)幽門螺桿菌發(fā)病機(jī)制的深入了解，已證實(shí)尿素酶、空泡毒素、粘附素和細(xì)胞毒性相關(guān)蛋白等對(duì)幽門螺桿菌的生長(zhǎng)起重要作用［8］，其中尿素酶對(duì)于幽門螺桿菌的生存和侵襲尤為關(guān)鍵［9］。1990年P(guān)allen等就提出以尿素酶作為抗原研制疫苗，隨后Tomb等對(duì)幽門螺桿菌基因進(jìn)行測(cè)序，發(fā)現(xiàn)至少7個(gè)幽門螺桿菌基因參與編碼催化活性的尿素酶，其中ureA、ureB編碼一個(gè)分子量大小約為550kDa多聚脫輔基酶蛋白，ureE、ureF、ureG、ureH、ureI編碼鎳離子結(jié)合到多聚脫輔基酶蛋白有關(guān)的輔助蛋白［10］。尿素酶蛋白在幽門螺桿菌中含量豐富，占菌體可溶性蛋白含量的6%，常分布于細(xì)胞表面。

ureB與尿素酶活性相關(guān)，是幽門螺桿菌在胃抵抗胃酸，分解尿素產(chǎn)生氨云的關(guān)鍵基因，也是定植的關(guān)鍵基因之一。ureB蛋白能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性免疫，常被作為疫苗候選基因［11］。ureI為質(zhì)子控尿素通道蛋白，該通道在中性pH時(shí)關(guān)閉，而pH為5.0時(shí)完全開放。尿素通過此通道進(jìn)入胞漿，被尿素酶分解中和周圍H＋，即使胃內(nèi)pH低于2.0，幽門螺桿菌周圍的pH也可保持在6.1左右，一般認(rèn)為ureI是幽門螺桿菌在人胃內(nèi)定植的必需基因［12］。ureI雖不參與尿酶的生物合成，但參與幽門螺桿菌H＋控尿素通道的過程，調(diào)控細(xì)胞內(nèi)尿素酶的代謝，對(duì)幽門螺桿菌在人和動(dòng)物體內(nèi)生存起重要作用［13，14］。

本研究從ureI和ureB基因中篩選T細(xì)胞和B細(xì)胞優(yōu)勢(shì)表位基因序列，串聯(lián)成600bp的含ureI和ureB雙基因的新序列，構(gòu)建原核重組表達(dá)質(zhì)粒和原核表達(dá)工程菌，研究工程菌的微生物學(xué)特性和表達(dá)重組蛋白（rIB）的免疫反應(yīng)性，了解該重組蛋白與幽門螺桿菌悉尼株（H.Pylori SS1）抗原蛋白的相關(guān)性。

1 材料和方法

1.1 材料

原核表達(dá)重組質(zhì)粒pET28a（＋）（卡那霉素抗性）購于 Novagen；BL21（DE3）為 Novagen產(chǎn)品。膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒購自O(shè)mega公司。Premix Taq酶、T4連接酶、限制性內(nèi)切酶EcoR I、Xho I、DNA Marker均購自Takara公司。PVDF膜及HRP標(biāo)記的羊抗雞IgG購自Earth公司。H.pylori SS1菌株、雞抗SS1特異抗體由四川萬可泰生物技術(shù)有限責(zé)任公司提供。

1.2 方法

1.2.1 幽門螺桿菌IB基因序列 依據(jù)GenBank中ureI和ureB DNA序列，經(jīng)生物信息學(xué)分析，從ureI和ureB基因中篩選富含人T細(xì)胞和B細(xì)胞表位的核苷酸序列，串聯(lián)成含ureB和ureI基因的新幽門螺桿菌ureI－B基因。在線預(yù)測(cè)網(wǎng)站網(wǎng)址如下：www.imtech.res.in／raghava／propred，www.epipredict.de／index.html。根據(jù) T、B細(xì)胞表位預(yù)測(cè)截取ureB和ureI的7個(gè)T、B細(xì)胞表位串聯(lián)做融合表達(dá)，預(yù)測(cè)無信號(hào)肽序列。全序列長(zhǎng)558bp［15］，序列如下：ggattaacca aagtcgatcc taaaagcacc aaaaaaggtt tggattggcg tccgtattct tggtataaaa aaatgtatgg ccctaccaca ggcgataaag tgcgtttgaa aaaatctgca atcaatcatg cgttagacgt tgcggacaaa tacgatgtgc aagtcgctat ccacacagac actaaaaaaa gcattaaagaagatgtccag ttcgctgatt cacgtatccg ccctcaaacc attgcggctg aagacacttt gcatgacatg gggattttct caatcaccag ttctgactct caagcgatgg gtcgtgtggg tgaagttatc actcgtactt ggcaaacagc tgacaaaaac aaaaaagaat ttggccgctt gaaagaagaa aaaggcgata acgacaactt caaaaaaccg gttaaaaatt gccgtaacat cactaaaaaa gacatgcaat tcaatgacac taccgctcac attgaagtca atcctgaaac ttaccatgtg ttcgtggatg gcaaagaagt cacttctaaa ccagctaata aagtgagc設(shè)計(jì)合成片段：每個(gè)抗原片段中間加兩個(gè)賴氨酸KK。5＇段引入EcoR I酶切點(diǎn)，3＇端引入Xho I酶切點(diǎn)，由北京金維智生物技術(shù)公司合成。用DNAMAN 6.0軟件預(yù)測(cè)：MW＝21kD，PI＝9.8。1.2.2 IB原核表達(dá)工程菌構(gòu)建和鑒定 參照分子克隆實(shí)驗(yàn)，將IB基因克隆入原核表達(dá)載體pET28a（＋）中，再將pET28a（＋）／IB原核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21（DE3）。篩選出含pET28a（＋）／IB質(zhì)粒的大腸桿菌，轉(zhuǎn)入含卡那霉素的LB培養(yǎng)基中。培養(yǎng)過夜，次日收集約3mL上述菌液抽提質(zhì)粒，EcoR I、XhoI雙酶切，1%瓊脂糖電泳觀察結(jié)果，并進(jìn)行DNA測(cè)序確認(rèn)。

1.2.3 IB原核表達(dá)質(zhì)粒穩(wěn)定性研究 用搖瓶模擬發(fā)酵過程，在非抗性培養(yǎng)基中傳代30代后，收集菌液，將菌液適當(dāng)稀釋后，接種到不含卡那霉素抗性的LB培養(yǎng)皿，37℃培養(yǎng)過夜。挑取100個(gè)菌落，接種到含卡那霉素抗性的LB培養(yǎng)皿，37℃培養(yǎng)過夜，統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)，計(jì)算質(zhì)粒保有率PR＝K＋／K－，K＋ 指在含卡那霉素抗性培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的CFU／mL；K－指在不含卡那霉素抗性培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的CFU／mL［16］。1.2.4 工程菌誘導(dǎo)表達(dá)分析 將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的大腸桿菌pET28a（＋）／IB按0.1%（V／V）的比例接種到LB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)3h左右，液體A600≈0.8時(shí)，加入1mmol／L的IPTG，22℃誘導(dǎo)4h后，4℃10 000r／min離心10min，分別收集沉淀和上清，沉淀經(jīng)PBS洗滌后用超聲緩沖液重懸菌體，超聲破碎（200W、20min、28次，間隔20min），4℃、10 000r／min離心20min，分別收集裂解上清與沉淀。沉淀用包涵體鑒定液（100mm／L TriCl，50 mmol／L EDTA，50mmol／L NaCl，pH 8.0）處理后，10g／L的SDS凝膠電泳分析。

1.2.5 重組IB蛋白的純化和免疫反應(yīng)分析 超聲破碎上清透析處理后，參照GE公司His Trap TM HP鎳純化柱說明書對(duì)表達(dá)的重組融合蛋白進(jìn)行純化，用一步法親和純化目標(biāo)蛋白，280mmol／L咪唑洗脫，0.01mol／L PBS透析；Lorry法測(cè)蛋白含量，SDS－PAGE和Gel－Pro Analyzer 4分析。純化蛋白SDS－PAGE電泳分離后，200mA恒流1h濕轉(zhuǎn)至PVDF膜 。含10mL／L牛血清的0.01mol／L PBS 4℃ 封閉過夜。用雞抗Hp ss1特異抗體IgY（1∶4 000），兔抗雞IgY的酶標(biāo)抗體（特異兔IgG－HRP，1∶1000）分別做一抗和二抗，37℃反應(yīng)1h，用PBST（含2mL／L Tween20的0.01mol／L PBS）洗滌3次，ECL試劑顯色。用不含目的基因的空質(zhì)粒大腸桿菌工程菌BL21DE3的誘導(dǎo)物做對(duì)照，研究工程菌產(chǎn)物中重組蛋白的免疫反應(yīng)原性。

2 結(jié)果

2.1 IB原核表達(dá)工程菌構(gòu)建和鑒定

EcoR I／Xho I雙酶切后，在1.0%瓊脂糖電泳上出現(xiàn)一條約為600bp的片段，與預(yù)期結(jié)果一致（見圖1）。原核表達(dá)質(zhì)粒pET28a（＋）／IB送金唯智公司測(cè)序，結(jié)果顯示插入基因序列正確，無突變，閱讀框架未發(fā)生改變。

2.2 IB原核表達(dá)工程菌穩(wěn)定性

工程菌傳代30代，其質(zhì)粒保有率均＞91%，說明重組工程菌中質(zhì)粒穩(wěn)定，丟失＜10%（見圖2）。

圖1 pET28a（＋）／IB中重組質(zhì)粒酶切分析

圖2 pET28a（＋）／IB中重組質(zhì)粒保有率

2.3 工程菌誘導(dǎo)表達(dá)情況

工程菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后在約28kD處出現(xiàn)一條蛋白條帶，與理論預(yù)測(cè)值相符（見圖3）。

2.4 重組IB蛋白的純化和免疫反應(yīng)分析

經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，目標(biāo)蛋白經(jīng)His Trap TM HP一步法親和純化后，以抗H.pylori SS1為特異抗體，Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果也在28kD左右出現(xiàn)特異反應(yīng)條帶，其分子量大小與理論值相符（見圖4）。

3 討論

利用原核表達(dá)系統(tǒng)可以使細(xì)菌細(xì)胞表達(dá)所需要的真核生物蛋白質(zhì)，該系統(tǒng)包括原核表達(dá)質(zhì)粒和表達(dá)宿主菌。本實(shí)驗(yàn)選用的pET28a（＋）質(zhì)粒是pET質(zhì)粒中的一員，pET質(zhì)粒是目前在大腸桿菌中克隆表達(dá)重組蛋白功能最強(qiáng)大的質(zhì)粒。目的基因被克隆到pET質(zhì)粒載體上后，受噬菌體T7強(qiáng)轉(zhuǎn)錄及翻譯信號(hào)控制，其表達(dá)由宿主細(xì)胞提供的T7RNA聚合酶誘導(dǎo)。T7RNA聚合酶誘導(dǎo)機(jī)制十分有效并具有選擇性：充分誘導(dǎo)時(shí)，幾乎所有的細(xì)胞資源都用于表達(dá)目的蛋白，誘導(dǎo)表達(dá)后幾小時(shí)，目的蛋白的量通?？烧季w總蛋白的50%以上。

3 pET28a（＋）／IB誘導(dǎo)前后SDS電泳

圖4 rIB蛋白純化前后的Western Blot實(shí)驗(yàn)

宿主菌大腸桿菌Transetta（DE3）可補(bǔ)充大腸桿菌缺乏的6種稀有密碼子（AUA、AGG、AGA、CUA、CCC、GGA）對(duì)應(yīng)的tRNA，提高外源基因在原核系統(tǒng)中的表達(dá)水平，而且Transetta（DE3）具有氯霉素（CamR）抗性，這就避免了轉(zhuǎn)化過程中可能帶來的操作污染。大腸桿菌Transetta（DE3）是噬菌體DE3的溶原菌，噬菌體DE3帶有l(wèi)acI基因、lacUV5啟動(dòng)子及T7RNA聚合酶基因。宿主菌形成溶原狀態(tài)后，在培養(yǎng)基中加入IPTG，受誘導(dǎo)的lacUV5啟動(dòng)子可指導(dǎo)T7RNA聚合酶基因轉(zhuǎn)錄，開始生產(chǎn)T7RNA聚合酶，繼而質(zhì)粒上的目的DNA開始轉(zhuǎn)錄。通過小培養(yǎng)優(yōu)化IPTG的最佳誘導(dǎo)濃度和誘導(dǎo)時(shí)間以達(dá)到完全誘導(dǎo)，可以使目的蛋白達(dá)到最大量和最佳溶解性。

本研究成功構(gòu)建原核表達(dá)質(zhì)粒pET28a（＋）／IB，并在大腸桿菌Transetta（DE3）表達(dá)出His標(biāo)簽的His－IB重組融合蛋白（rIB）。將目標(biāo)序列測(cè)序結(jié)果遞交NCBI進(jìn)行BLAST比對(duì)，結(jié)果與較為常見的標(biāo)準(zhǔn)菌株 H.pylori SS1、H.Pylori 26695、H.pylori J99和H.pylori G27菌株的UreB一致性分別為100%、97%、100%、99%，與這些菌株中ureI基因一致性均為100%。證實(shí)來源于幽門螺桿菌ureI和ureB基因的重組基因ureI－B屬于高保守序列。經(jīng)對(duì)IPTG表達(dá)條件的優(yōu)化，表達(dá)的rIB經(jīng)純化后純度達(dá)90%，Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)可與抗H.pylori SS1特異抗體結(jié)合，說明其具有良好的免疫原性。

重組質(zhì)粒pET28a（＋）／IB長(zhǎng)期穩(wěn)定表達(dá)是疫苗成功的關(guān)鍵之一。原核表達(dá)工程菌IB連續(xù)傳代30代未見質(zhì)粒丟失，重組蛋白表達(dá)穩(wěn)定，這為表達(dá)工程菌IB作為H.pylori的治療和預(yù)防性疫苗開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。

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