激動(dòng)GHB受體對大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用及機(jī)制探討

楊其俠，秦 浩，郝 偉，賀大偉，谷淑玲

(1徐州醫(yī)學(xué)院，江蘇徐州221002;2棗莊市立醫(yī)院;3棗礦集團(tuán)中心醫(yī)院)

γ-羥基丁酸(GHB)是腦內(nèi)天然存在的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)或調(diào)質(zhì)，能自由通過血腦屏障。它由GABA轉(zhuǎn)化而來，其化學(xué)結(jié)構(gòu)與GABA相似［1］。多項(xiàng)研究證實(shí)腦內(nèi)存在特異性GHB受體。哺乳動(dòng)物腦內(nèi)GHB受體呈現(xiàn)不均勻分布，它專一表達(dá)于包括額葉皮層在內(nèi)的整個(gè)大腦皮層、紋狀體、嗅束、丘腦及A9、A10、A12等多巴胺能神經(jīng)核團(tuán)［2］。最近的報(bào)道稱在大鼠腦內(nèi)已克隆出GHB受體的cDNA［3］，并證實(shí)GHB受體屬于G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)大家族且存在多種亞型［4，5］。但關(guān)于 Gi蛋白在激動(dòng) GHB受體對大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷保護(hù)作用中的變化，目前尚未見報(bào)道。我們于2008年3月～2010年7月進(jìn)行本實(shí)驗(yàn)，采用GHB受體選擇性激動(dòng)劑NCS-356作為工具藥，觀察Gi蛋白在激動(dòng)GHB受體對大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷保護(hù)作用中的變化。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 NCS-356，Sigma公司產(chǎn)品;Gi抗體，Sigma公司產(chǎn)品;AP標(biāo)記羊抗兔血清二抗，北京中杉公司。江灣Ⅰ型C立體定位儀，上海第二軍醫(yī)大學(xué)修配廠;752紫外分光光度計(jì)，上海分析儀器廠;圖像采集及分析系統(tǒng)，德國Leica Qwin。

1.2 動(dòng)物分組及模型制備 40只清潔級SD大鼠，體質(zhì)量約250 g，隨機(jī)分為5組，分別是假手術(shù)組，缺血再灌注(I/R)組，NCS-356 160、320 和 640 μg/kg組。假手術(shù)組只分離動(dòng)脈，不結(jié)扎、插線。其余組參照改良Longa法［6］制備缺血再灌注模型，具體方法:10%水合氯醛腹腔注射麻醉，頸部手術(shù)區(qū)備皮，70%乙醇消毒，頸部正中切口，右側(cè)頸動(dòng)脈鞘處分離頸總動(dòng)脈(CCA)、頸外動(dòng)脈(ECA)和頸內(nèi)動(dòng)脈，結(jié)扎翼腭突動(dòng)脈、ECA及CCA，在CCA結(jié)扎處遠(yuǎn)心端剪一斜切口，插入栓線(直徑0.20 mm單股尼龍線50 mm，將頭端加熱成球形，在光鏡下成光滑圓球，于線端18.5 mm處作標(biāo)記)，進(jìn)線17～21 mm時(shí)，感到明顯阻力，證明栓線頭端已達(dá)大腦中動(dòng)脈起始處，開始計(jì)算缺血時(shí)間，在CCA插口結(jié)扎、固定栓線，逐層縫合。2 h后拔出栓線，即可得到前后交通動(dòng)脈血供，此為再灌注期。模型制作成功的判定參照Longa 5分制評分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行神經(jīng)功能評分，實(shí)驗(yàn)過程中死亡或大出血、評分為0分和4分者均被剔除。

各組大鼠俯臥位固定于腦立體定位儀上，矢狀切開頭皮至顱骨，以前囟為基點(diǎn)，后移1.5 mm、右移1.5 mm處鉆開顱骨，以顱骨表面為準(zhǔn)，垂直進(jìn)針4.5 mm，各組分別用微量注射器將10 μL藥物，假手術(shù)組不注射任何藥物，I/R組注射生理鹽水，NCS-356 160 μg/kg 組注射 NCS-356 40 μg，NCS-356 320 μg/kg 組注射NCS-356 80 μg，NCS-356 640 μg/kg 組注射 NCS-356 160 μg，均以 0.35 μL/min 速度注入大鼠側(cè)腦室，注射后留針10 min，再撤出微量注射器，骨蠟封閉小孔，常規(guī)局部消毒，縫合切口。40只大鼠腦缺血再灌注24 h處死后，取新鮮缺血腦皮層組織約100 mg(取視交叉前后約5 mm的缺血腦皮層組織)置于－70℃冰箱，Western blot法測定Gi水平。

1.3 神經(jīng)功能評分 大鼠缺血再灌注24 h后采用5分制法［7］進(jìn)行神經(jīng)功能評分:①前肢蜷曲:提起大鼠尾巴時(shí)無屈曲癥狀者0分，輕度左前肢偏癱肩內(nèi)收者0.5分，中度或重度左前肢偏癱肩內(nèi)收者1.0分;②抗側(cè)推能力:自大鼠肩后向兩側(cè)推擋，阻力一樣者0分，阻力輕度減弱者0.5分，沒有阻力者1.0分;③身體轉(zhuǎn)圈:提起大鼠尾巴無轉(zhuǎn)圈者0分，向癱瘓側(cè)有輕度轉(zhuǎn)圈者0.5分，中度以上并有身體轉(zhuǎn)圈者1.0分;④自主活動(dòng)的程度:大鼠活動(dòng)正常者0分，自主活動(dòng)較正常減少者1.0分，活動(dòng)需要激惹的1.5分，失去自發(fā)活動(dòng)能力者2.0分。大鼠評分為0分的予以剔除，并隨機(jī)補(bǔ)充，保證每組8只大鼠。分值越高說明大鼠行為障礙越嚴(yán)重。

1.4 Western blot法測定Gi含量 分別取各組樣品加入勻漿液進(jìn)行勻漿，采用紫外吸收法進(jìn)行蛋白含量測定。將蛋白處理液加入樣品中，100℃或沸水浴加熱3～5 min，以充分變性蛋白。處理好的樣品置于－20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩２捎?%的濃縮膠和10%聚丙烯酰胺分離膠，每孔加入30 μg蛋白樣品，置電泳緩沖液中，100 V電泳，條帶壓縮整齊后調(diào)至200 V，電泳時(shí)溴酚藍(lán)到達(dá)膠的底端處附近停止電泳。將凝膠上的蛋白條帶轉(zhuǎn)移到NC膜上，蛋白膜放置到Western洗滌液中漂洗，再將轉(zhuǎn)移好的NC膜放入封閉液中搖床上室溫封閉1 h，吸盡封閉液后取出NC膜，放入1∶200兔抗大鼠Gi抗體液中搖30 min，再放4℃冰箱過夜。次日回收一抗，洗膜，加入1∶30 000 AP標(biāo)記羊抗兔二抗稀釋液，振搖1 h，回收二抗，洗膜，將NC膜放入含NBT和BCIP的顯色液中，搖晃顯色，將顯色后的NC膜掃描，留做條帶灰度分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)以ˉx±s表示，多組間比較采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)方差分析法(ANOVA)，多組間兩兩比較采用q檢驗(yàn)。以P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

大鼠神經(jīng)功能評分及Gi含量檢測結(jié)果見表1。

表1 大鼠神經(jīng)功能評分及Gi含量檢測結(jié)果(ˉx±s)

3 討論

Snead［4］發(fā)現(xiàn)GHB誘導(dǎo)由G蛋白介導(dǎo)的腺苷酸環(huán)化酶(AC)的減少是通過G蛋白偶聯(lián)的突觸前受體介導(dǎo)的，Ratomponirina也發(fā)現(xiàn)GHB受體結(jié)合位點(diǎn)能特異性被鳥苷酸和百日咳毒素所阻斷，以上結(jié)果支持腦內(nèi)GHB受體屬于鳥嘌呤核苷酸(如Go或Gi)受體家族［5］。GHB 的鈉鹽 γ-羥丁酸鈉(SO)已被證實(shí)對大鼠缺血腦皮層神經(jīng)元有保護(hù)作用，且SO的腦保護(hù)作用與激動(dòng)GHB受體有關(guān)［8～11］。我們前期的研究證實(shí)，SO對大鼠局灶性腦缺血、沙土鼠全腦缺血和培養(yǎng)大鼠缺氧復(fù)氧皮層神經(jīng)元具有神經(jīng)保護(hù)作用，并初步證實(shí)該作用與GABA及其受體亞型有關(guān)［9，10］，但 GABA 受體阻斷劑僅能部分對抗 SO對腦缺血的保護(hù)作用，提示SO的腦保護(hù)作用不僅與GABA受體有關(guān)，可能還有其他的機(jī)制參與。我們在大鼠海馬腦片上發(fā)現(xiàn)，GHB受體特異性阻斷劑NCS-382也可部分對抗SO的腦保護(hù)作用，提示SO對腦缺血的保護(hù)作用既與激動(dòng)GABA受體有關(guān)，又與激動(dòng)GHB受體有關(guān)［11］。這為探討GHB受體在缺血性腦損傷中的作用奠定了很好的基礎(chǔ)。因此進(jìn)一步探討GHB受體在缺血性腦損傷中所起的作用，以及在缺血性腦損傷中GHB受體可能的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路很有必要。

本研究結(jié)果顯示，激動(dòng)GHB受體可以改善大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷引起的行為功能障礙，進(jìn)一步證實(shí)了本實(shí)驗(yàn)室及其他實(shí)驗(yàn)室先前的結(jié)論［11］。實(shí)驗(yàn)結(jié)果還顯示，I/R組大鼠缺血側(cè)大腦皮質(zhì)Gi水平明顯低于Sham組，說明大鼠腦皮層細(xì)胞Gi水平改變可能參與了大鼠腦缺血再灌注的分子生物學(xué)發(fā)病機(jī)制。大鼠腦缺血前和再灌時(shí)給予GHB受體激動(dòng)劑NCS-356，能升高大鼠腦缺血再灌注后皮層細(xì)胞的Gi含量，且隨其劑量的增加作用增強(qiáng)。以上結(jié)果提示，在大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷中激動(dòng)GHB受體產(chǎn)生的腦保護(hù)作用與其激動(dòng)Gi蛋白有關(guān)。

GPCR是研究最為廣泛的一類受體，他們組成不同功能的超大家族，目前已知的GPCR已多達(dá)1 000多種，而且數(shù)量還在增加。G蛋白是近年來在生物細(xì)胞膜發(fā)現(xiàn)的一組與三磷酸鳥苷(GTP)相結(jié)合的蛋白質(zhì)，其主要功能是將激素或神經(jīng)遞質(zhì)信息由細(xì)胞膜外的受體傳遞至細(xì)胞膜內(nèi)表面的效應(yīng)器，在神經(jīng)細(xì)胞的生長、分化、代謝及功能活動(dòng)中發(fā)揮十分廣泛而基礎(chǔ)的作用，是胞外信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)子和放大器，起著“分子開關(guān)”的作用。Gi是一種抑制性G蛋白，其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路為Gi抑制AC的激活，從而抑制了AC催化ATP生成cAMP，進(jìn)而抑制PKA的激活與p-CREB的生成。

在SO對大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用中，可能是SO與細(xì)胞表面的Gi蛋白偶聯(lián)受體結(jié)合激活腺苷交換，G蛋白的α亞基和β、γ亞基復(fù)合體解離，解離后的α亞基抑制AC活性，從而改變細(xì)胞內(nèi)第二信使如cAMP的水平，影響蛋白激酶活性進(jìn)而影響特定蛋白磷酸化及基因表達(dá)。

GHB受體作為一種G蛋白家族偶聯(lián)受體，由于存在不同類型的G蛋白亞基，不同亞基通過不同通路產(chǎn)生不同的生物學(xué)效應(yīng)，而本實(shí)驗(yàn)僅研究了Gi蛋白在激動(dòng)GHB受體對大鼠腦缺血再灌注損傷保護(hù)作用中的含量變化，希望進(jìn)一步完善GHB對大鼠腦缺血保護(hù)作用的分子機(jī)制，為臨床治療缺血性腦損傷提供一個(gè)新的藥靶。但是腦缺血再灌注性損傷發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，要全面了解激動(dòng)GHB受體對腦缺血的保護(hù)作用機(jī)制還需做進(jìn)一步深入的研究。

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