同型半胱氨酸對(duì)心肌細(xì)胞質(zhì)量及蛋白質(zhì)合成的影響

李素梅 劉 燕 冉張申 孫麗珍 郭軍鳳 李秀昌

(1泰山醫(yī)學(xué)院校醫(yī)院，山東泰安 271000;2泰山醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，山東泰安 271000)

血清同型半胱氨酸水平升高已經(jīng)被確定為心血管疾病的重要獨(dú)立危險(xiǎn)因素，血液中同型半胱氨酸水平增高可損害血管內(nèi)皮功能，促進(jìn)平滑肌細(xì)胞增殖，促進(jìn)粥樣斑塊形成［1，2］。既往的研究中發(fā)現(xiàn)臨床病人中血清同型半胱氨酸水平與左室心肌重量及左室心肌重量指數(shù)呈顯著正相關(guān)，而且這種正相關(guān)獨(dú)立于其他已知因素(如高血壓、各種神經(jīng)內(nèi)分泌因素等)［3］，Wejksza等證明小鼠喂飼高半胱氨酸飲食誘發(fā)高同型半胱氨酸血癥能誘導(dǎo)左室心肌重量增加［4］。國(guó)外有研究表明同型半胱氨酸能促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)重構(gòu)，增加心肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度［5］，因此血清同型半胱氨酸增高可能與心肌細(xì)胞肥大有關(guān)。同型半胱氨酸是否確能導(dǎo)致單個(gè)心肌細(xì)胞肥大，是否對(duì)心肌細(xì)胞蛋白質(zhì)合成產(chǎn)生影響，尚有待進(jìn)一步明確。本研究以培養(yǎng)的SD乳鼠心肌細(xì)胞為試驗(yàn)?zāi)Ｐ?，觀察同型半胱氨酸對(duì)心肌細(xì)胞質(zhì)量和蛋白質(zhì)合成的影響。

1 材料與方法

1．1 材料與試劑

新生(24 h內(nèi))SD乳鼠購(gòu)自山東農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。同型半胱氨酸、胰酶、膠原酶II購(gòu)于美國(guó) Sigma公司;DMEM、ITS 購(gòu)自 Gibco公司;［3H］－Leu由中國(guó)原子能科學(xué)研究所提供;所用儀器主要包括日本三洋MCO－15AC型CO2培養(yǎng)箱，德國(guó)Beckman LS3810型液體閃爍儀，德國(guó)Leica2Q500心肌細(xì)胞圖像分析系統(tǒng)等。

1．2 心肌細(xì)胞培養(yǎng)

取新生SD大鼠8只，參考Simpson等［6］的方法培養(yǎng)新生大鼠心肌細(xì)胞。簡(jiǎn)述之，超凈工作環(huán)境下手術(shù)取出大鼠心臟，洗凈血液剪去心房肌，將心室肌剪碎，采用0．08%膠原酶II+0．125%胰酶等比混合物消化后差速貼壁法去除非心肌細(xì)胞，將未貼壁細(xì)胞加入含150 ml/L胎牛血清、0．1 mmol/L 5－溴脫氧核苷的高糖DMEM 3ml培養(yǎng)液，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)獲得心肌細(xì)胞。

1．3 心肌細(xì)胞鑒定

常規(guī)倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)、心肌細(xì)胞搏動(dòng)情況，在倒置顯微鏡下觀察到心肌細(xì)胞搏動(dòng)頻率＞100次/分，并經(jīng)心肌肌鈣蛋白－I染色陽(yáng)性鑒定為心肌細(xì)胞。

1．4 蛋白含量測(cè)定

接種心肌細(xì)胞于24孔培養(yǎng)板(共兩板，48孔)，每孔細(xì)胞計(jì)數(shù)1×105，48 h后換無(wú)血清培養(yǎng)液，24 h后實(shí)驗(yàn)組(共36孔，分為三組，每組12孔)分別加不同濃度同型半胱氨酸(0．1 mmol/L，0．5 mmol/L，1 mmol/l)繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，用0．25%胰蛋白酶消化細(xì)胞，PBS沖洗離心重懸細(xì)胞，充分裂解后，12000 r/min低溫離心，采用Lowry法測(cè)定心肌細(xì)胞蛋白含量，根據(jù)每孔細(xì)胞數(shù)，計(jì)算出單個(gè)心肌細(xì)胞的蛋白質(zhì)含量。

1．5 單個(gè)心肌細(xì)胞表面積測(cè)定

將貼壁生長(zhǎng)的心肌細(xì)胞接種于6孔板中(共4板，24孔)，實(shí)驗(yàn)組(每組6孔)分別加入不同濃度的同型半胱氨酸(0．1 mmol/L，0．5 mmol/L，1 mmol/l)培養(yǎng)24 h，將培養(yǎng)的細(xì)胞用95%酒精固定后行HE染色，采用Leica2Q500心肌細(xì)胞圖像分析系統(tǒng)測(cè)定心肌細(xì)胞表面積，每個(gè)視野測(cè)5～10個(gè)細(xì)胞，每張玻片隨機(jī)取5個(gè)視野，取平均值。

1．6 心肌細(xì)胞蛋白合成速率測(cè)定

將培養(yǎng)的心肌細(xì)胞按3×108cells/L密度接種于24孔培養(yǎng)板(共兩板，48孔)。48 h后換無(wú)血清培養(yǎng)液，24 h后實(shí)驗(yàn)組(共36孔，分為三組，每組12孔)分別加不同濃度同型半胱氨酸(0．1 mmol/L，0.5 mmol/L，1 mmol/l)繼續(xù)培養(yǎng)18 h，然后均加入［3H］－ Leu(1 μl/ml)再培養(yǎng)6 h ，用 PBS洗去游離的同位素標(biāo)記物，將細(xì)胞收集于玻璃纖維濾膜上，然后用100 g/L三氯乙酸沖洗和無(wú)水乙醇再?zèng)_洗，濾膜烘干后置于含4 ml閃爍液的液閃杯中，以液體閃爍儀測(cè)定每孔放射強(qiáng)度，均測(cè)量3次取平均值。

1．7 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié) 果

2．1 同型半胱氨酸對(duì)心肌細(xì)胞蛋白質(zhì)含量的影響

與對(duì)照組相比，經(jīng)同型半胱氨酸作用后，單個(gè)心肌細(xì)胞蛋白質(zhì)含量明顯增加，不同濃度同型半胱氨酸實(shí)驗(yàn)組均明顯高于對(duì)照組，而且隨同型半胱氨酸濃度升高，單個(gè)心肌細(xì)胞質(zhì)量也隨之增加(見表1)。

2．2 同型半胱氨酸對(duì)心肌細(xì)胞表面積的影響

經(jīng)同型半胱氨酸作用后，實(shí)驗(yàn)組單個(gè)心肌細(xì)胞表面積顯著高于對(duì)照組，在不同濃度同型半胱氨酸作用的實(shí)驗(yàn)組中，單個(gè)心肌細(xì)胞表面積隨同型半胱氨酸濃度升高而升高(見表1)，統(tǒng)計(jì)分析表明上述差異具有顯著性。

表1 不同濃度的同型半胱氨酸對(duì)心肌細(xì)胞蛋白含量、表面積和蛋白質(zhì)合成的影響

2．3 同型半胱氨酸對(duì)心肌細(xì)胞蛋白質(zhì)合成速率的影響

以［3H］－Leu摻入量來(lái)評(píng)價(jià)同型半胱氨酸對(duì)心肌細(xì)胞蛋白合成速率的影響，與對(duì)照組相比，用同型半胱氨酸作用6 h后的心肌細(xì)胞［3H］－Leu摻入量顯著高于對(duì)照組，而且在三組實(shí)驗(yàn)組中，心肌細(xì)胞蛋白質(zhì)合成速率隨同型半胱氨酸濃度升高而增高(見表1)，統(tǒng)計(jì)分析表明上述差異具有顯著性。

3 討 論

流行病學(xué)顯示，心肌肥厚是心血管事件發(fā)生率、死亡率增加的重要獨(dú)立危險(xiǎn)因素及心臟性死亡的強(qiáng)有力的預(yù)測(cè)指標(biāo)［7］。心肌細(xì)胞肥大、心臟成纖維細(xì)胞增殖及膠原合成是心肌肥厚的主要病理學(xué)基礎(chǔ)。導(dǎo)致心肌肥厚的原因很多，包括負(fù)荷過(guò)重、神經(jīng)－內(nèi)分泌信號(hào)(如去甲腎上腺素)、代謝信號(hào)(如缺氧/缺血、活性氧)、心肌組織釋放的局部激素及細(xì)胞因子等［8］，但這些仍不能完全解釋心肌肥厚的原因。我們既往的臨床研究表明，血清同型半胱氨酸水平與左室心肌質(zhì)量及左室心肌重量指數(shù)呈顯著正相關(guān)，而且這種正相關(guān)獨(dú)立于其他已知因素(如高血壓、各種神經(jīng)內(nèi)分泌因素)［4］，但同型半胱氨酸是否確能導(dǎo)致心肌細(xì)胞肥大和蛋白質(zhì)合成增加仍未明確，本研究即在培養(yǎng)的心肌細(xì)胞中初步研究了同型半胱氨酸對(duì)心肌細(xì)胞肥大和蛋白質(zhì)合成的影響。

同型半胱氨酸已被確定為動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，研究表明同型半胱氨酸對(duì)血管平滑肌細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞具有明顯的促增殖效應(yīng)［9］，也有研究表明型半胱氨酸能促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)重構(gòu)，增加心肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度［6］，而鈣超載則是心肌細(xì)胞肥大的重要機(jī)制之一，因此同型半胱氨酸可能與心肌細(xì)胞肥大有關(guān)。我們的研究證明，經(jīng)同型半胱氨酸作用的心肌細(xì)胞單個(gè)細(xì)胞蛋白質(zhì)含量明顯高于正常對(duì)照組，而且同型半胱氨酸對(duì)心肌細(xì)胞蛋白質(zhì)含量的影響與同型半胱氨酸濃度成正相關(guān)，隨著同型半胱氨酸濃度的升高，單個(gè)心肌細(xì)胞蛋白質(zhì)含量也隨之升高，這進(jìn)一步證明了同型半胱氨酸能促進(jìn)心肌細(xì)胞蛋白質(zhì)的合成。

本研究證明在體外培養(yǎng)的心肌細(xì)胞中同型半胱氨酸還可導(dǎo)致單個(gè)心肌細(xì)胞表面積增加，表明同型半胱氨酸可促進(jìn)心肌細(xì)胞體積增大，而且單個(gè)心肌細(xì)胞表面積與同型半胱氨酸濃度成正相關(guān)，說(shuō)明同型半胱氨酸可能通過(guò)某種機(jī)制導(dǎo)致心肌細(xì)胞肥大，這可部分解釋我們既往的研究中血清同型半胱氨酸水平與左室心肌重量呈顯著正相關(guān)的結(jié)論［4］。

為評(píng)價(jià)不同濃度同型半胱氨酸對(duì)心肌細(xì)胞蛋白質(zhì)合成速率的影響，我們采用［3H］－Leu摻入法測(cè)定了同型半胱氨酸對(duì)心肌細(xì)胞蛋白質(zhì)合成速率的影響，結(jié)果顯示經(jīng)同型半胱氨酸作用的心肌細(xì)胞［3H］－Leu摻入量顯著高于對(duì)照組，而且其摻入量與同型半胱氨酸濃度成正相關(guān)，說(shuō)明同型半胱氨酸能促進(jìn)心肌細(xì)胞蛋白質(zhì)的合成速率，這可能是導(dǎo)致心肌細(xì)胞蛋白質(zhì)含量增加和心肌細(xì)胞肥大的原因之一，但關(guān)于同型半胱氨酸促進(jìn)蛋白質(zhì)合成的機(jī)制尚有待于進(jìn)一步研究。

綜上所述，同型半胱氨酸在培養(yǎng)的心肌細(xì)胞中能促進(jìn)蛋白質(zhì)的合成，導(dǎo)致心肌細(xì)胞質(zhì)量增加和細(xì)胞表面積增加，從而導(dǎo)致心肌細(xì)胞肥大。

［1］ Jacob T，Hingorani A，Ascher E．Evidence for telomerase activation in VSMCs exposed to hyperglycemic and hyperhomocysteinemic conditions［J］．Angiology，2009，60(5):562-568．

［2］ Wejksza K，Rzeski W，Turski WA．Kynurenic acid protects against the homocysteine－induced impairment of endothelial cells［J］．Pharmacol Rep，2009，61(4):751-756．

［3］ 李秀昌，胡燕燕，張運(yùn)，等．血清同型半胱氨酸對(duì)心臟結(jié)構(gòu)和功能影響的研究［J］．中國(guó)超聲醫(yī)學(xué)雜志，2001，17(2):103-105．

［4］ Singh AP，Singh M，Balakumar P．Effect of mast cell stabilizers in hyperhomocysteinemia－induced cardiac hypertrophy in rats［J］．J Cardiovasc Pharmacol，2008，51(6):596-604．

［5］ Carroll JF，Tyagi SC．Extracellular matrix remodeling in the heart of the homocysteinemic obese rabbit［J］．Am J Hypertens，2005，18(5 Pt 1):692-698．

［6］ Keda K，Tojo K，Udagawa T，et al．Cellular physiology of rat cardiac myocytes in cardiac fibrosis:in vitro simulation using the cardiac myocyte/cardiac non－myocyte co－culture system［J］．Hypertens Res，2008，31(4):693-706．

［7］ Brown DW，Giles WH，Croft JB．Left ventricular hypertrophy as a predictor of coronary heart disease mortality and the effect of hypertension［J］．Am Heart J，2000，140:848-856．

［8］ Nakagami H，Takemoto M ，Liao J K．NADPH oxidase－derivedsuperoxide anion mediates angiotensinⅡ2induced cardiac hypertrophy［J］．J Mol Cell Cardiol，2003，35(7):851．

［9］ Akalin A，Alatas O，Colak O．Relation of plasma homocysteine levels to atherosclerotic vascular disease and inflammation markers in type 2 diabetic patients［J］．Eur J Endocrinol，2008，158(1):47-52．