脂氧素A4對內(nèi)毒素休克大鼠生存率及血漿炎性因子水平的影響

亓云法 許會彬 王克強

(1．泰山醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院檢驗科，山東泰安 271000;2．解放軍第八十八醫(yī)院檢驗科，山東泰安 271000)

內(nèi)毒素休克是臨床上常貝的危重病癥之一，死亡率高達 30 ～60%［1，2］。常并發(fā)于感染、創(chuàng)傷、燒傷、放射損傷、失血性休克以及大手術(shù)等。其發(fā)病急驟，可累及多個器官，甚至可導(dǎo)致多器官功能障礙綜合征(MODS)，而過度炎癥反應(yīng)是引起組織損傷和器官功能紊亂的重要原因。脂氧素A4(LXA4)作為一種內(nèi)源性脂類介質(zhì)，通過抑制中性粒細胞的趨化、黏附和炎性介質(zhì)的釋放等而具有廣泛的抗炎作用，被稱為是炎癥反應(yīng)的"剎車信號"［3］。

本實驗通過LXA4預(yù)處理內(nèi)毒素休克大鼠模型，觀察大鼠血漿TNF－α、IL－10及丙二醛(MDA)的水平，初步探討LXA4對內(nèi)毒素休克的影響。

1 材料與方法

1．1 材料

1．1．1 動物模型及分組

雄性Wistar大鼠30只，體重(250±10)g(由中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心提供)，隨機分成生理鹽水(NS)對照組(A組)、內(nèi)毒素(LPS)休克組(B組)和LXA4干預(yù)組(C組)，每組10只。

1．1．2 主要試劑

脂氧素 A4(Lipoxin A4 methyl ester，美國 Cayman公司生產(chǎn)，溶于10%乙醇);大腸桿菌內(nèi)毒素脂多糖(LPS，E．Coli 055:B5，美國Sigma公司生產(chǎn));丙二醛(MDA)測定試劑盒、超氧化物歧化酶(SOD)測定試劑盒，TNF－α測定試劑盒、IL－10測定試劑盒(南京建成生物工程研究所產(chǎn)品)。

1．2 方法

1．2．1 模型制作方法參考文獻［4］，LPS(大腸桿菌內(nèi)毒素脂多糖，E．Coli 055:B5，美國Sigma公司生產(chǎn))給予量為5mg/kg體重，LXA4［脂氧素 A4，Lipoxin A4 methyl ester，美國Cayman公司生產(chǎn)，溶于10%乙醇］給予量為0．1mg/kg體重。LXA4干預(yù)組:尾靜脈注射LPS及LXA4;內(nèi)毒素休克組:尾靜脈注射LPS加與LXA4等量的10%乙醇;對照組:尾靜脈注射等量生理鹽水及10%乙醇。

1．2．2 樣品采集

模型制成3h后，經(jīng)頸動脈采血2．0 ml，置于肝素抗凝管，3000 r/min離心10 min，取血漿－30℃凍存待測。

1．3 大鼠存活時間監(jiān)測

LPS注射后1h開始觀察各組大鼠的生存情況，并記錄死亡時間，總的觀察時間為24 h。

1．4 炎性因子檢測

分別采用ELISA方法檢測血漿TNF－α、IL－10水平，硫代巴比妥酸法檢測MDA含量，黃嘌呤氧化酶法測定超氧化物岐化酶(SOD)活性。以上試劑盒均為南京建成生物工程研究所產(chǎn)品，測定步驟完全按照試劑盒說明書。

1．5 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 12．0統(tǒng)計軟件包進行分析。計量資料以均數(shù)士標準差(±s)表示，多組間比較采用方差分析，以P＜0．05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 存活時間比較

各組大鼠的存活時間如表1所示。對照組大鼠無一例死亡;內(nèi)毒素組大鼠活動減少，蜷縮無力，口唇青紫，12h時的死亡率達100%，中位生存時間是9．16 h;而LXA4干預(yù)組大鼠存活時間均較內(nèi)毒素組明顯延長(log－rank檢驗，P ＜0．01)，12 h死亡率為20%，中位生存時間為16．25 h。表明LXA4能明顯延長內(nèi)毒素休克大鼠的存活時間。

表1 大鼠存活時間比較

2．2 血漿TNF－α、IL－10、MDA及SOD水平比較

與A組比較，B組血漿 TNF－α、IL－10及MDA水平顯著升高(P＜0．01)，SOD水平明顯下降(P＜0．01);C組血漿TNF－α、MDA水平較B組顯著降低(P＜0．01)，IL－10及SOD水平明顯上升(P ＜0．01)。結(jié)果見表2。

表2 血漿TNF－α、IL－10、MDA及SOD水平比較(±s)

表2 血漿TNF－α、IL－10、MDA及SOD水平比較(±s)

*表示A組 VS B組P＜0．01;#表示 B組 VS C組P＜0．01

組別(n=10) TNF－a(pg/mL) IL－10(pg/mL) MDA(mol/L) SOD(KU/L)A 組 38．26 ±9．17 34．16 ±7．39 4．57 ±0．81 355．06 ±39．23 B 組 114．51 ±28．49* 215．71 ±31．22* 7．72 ±1．35* 272．38 ±31．22*C 組 78．52 ±20．31# 261．03 ±23．92# 5．65 ±1．29# 328．56 ±44．59#

3 討論

內(nèi)毒素休克是嚴重創(chuàng)傷患者及臨床危重病患者的一種常見并發(fā)癥，也是引起多臟器功能衰竭甚至死亡的重要原因。內(nèi)毒素休克病程進展可能涉及多種因素，包括炎癥介質(zhì)反應(yīng)、炎癥的級聯(lián)反應(yīng)、氧自由基的毒性、血管活性物質(zhì)的作用以及微血栓形成等，而多臟器功能衰竭是全身性炎癥反應(yīng)綜合征進展過程中的嚴重階段，往往預(yù)后不良。因此，對內(nèi)毒素休克救治措施的探討一直倍受關(guān)注。

脂氧素(LX)是二十烷家族中一類花生四烯酸脂加氧酶代謝產(chǎn)物，LXA4是LX最主要的家族成員之一。LXA4在促炎介質(zhì)前列素E2和白三烯之后產(chǎn)生，是目前所知體內(nèi)重要的內(nèi)源性促炎癥消退介質(zhì)。一方面，LXA4通過拮抗白三烯、抑制白細胞游走、黏附分子及趨化因子受體表達，抑制炎癥反應(yīng)的進一步惡化。另一方面，LXA4通過促進巨噬細胞對凋亡的中性粒細胞的吞噬，及時清除中性粒細胞，促進炎癥消退［5，6］。

本研究應(yīng)用LXA4對內(nèi)毒素休克大鼠進行了干預(yù)并與休克組相比較，結(jié)果顯示內(nèi)毒素組大鼠活動減少，蜷縮無力，口唇青紫，12h時的死亡率達100%，中位生存時間是9．16 h;而LXA4干預(yù)組大鼠存活時間均較內(nèi)毒素組明顯延長，12h死亡率為20%，中位生存時間為16．25 h。表明LXA4能明顯延長內(nèi)毒素休克大鼠的存活時間。

腫瘤壞死因子－α(TNF－α)是由激活的單核－巨噬細胞產(chǎn)生的一種具有多種生物活性的多肽細胞因子，與機體免疫反應(yīng)、急性期反應(yīng)及炎癥反應(yīng)關(guān)系密切，它可通過激活細胞因子網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)而誘發(fā)全身炎性反應(yīng)。TNF－α是內(nèi)毒素休克時最早釋放且起關(guān)鍵作用的介質(zhì)，是內(nèi)毒素休克的重要起始因子，并在發(fā)展過程中起放大作用，即所謂的免疫炎癥的瀑布反應(yīng)，進而引起廣泛的凝血，出現(xiàn)毛細血管滲漏綜合征，使全身脫水和肺衰竭，導(dǎo)致全身性炎癥反應(yīng)綜合征。IL－10主要由Th2細胞、活化的單核－巨噬細胞和上皮細胞產(chǎn)生，是一種重要的抗炎性細胞因子，能在轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平上抑制前炎癥因子的合成與釋放，調(diào)節(jié)T細胞、B細胞、NK細胞、抗原提呈細胞、肥大細胞及粒細胞等免疫細胞的分化和增殖。體外實驗研究顯示，IL－10抑制TNF－α、IL－1、IL－6、IL－8等多種炎癥介質(zhì)的同時可上調(diào)可溶性TNF受體等抗炎物質(zhì)，有利于重建體內(nèi)炎癥介質(zhì)/抗炎介質(zhì)的平衡。嚴重損傷和感染時，血液中不但有大量促炎介質(zhì)，抗炎介質(zhì)也大量釋放。

本研究顯示內(nèi)毒素休克組血漿TNF－α、IL－10水平較對照組顯著升高(P＜0．01);而LXA4組血漿TNF－α水平較休克組顯著降低(P＜0．01)，IL－10水平明顯上升(P＜0．01)。表明LXA4一方面可以抑制炎性介質(zhì)TNF－α的產(chǎn)生，另一方面可以促進抗炎性介質(zhì)IL－10的生成。

MDA是細胞膜脂質(zhì)過氧化的最終分解產(chǎn)物，其含量的高低可反映機體細胞受自由基攻擊的嚴重程度。脂質(zhì)過氧化作用是在不飽和脂肪酸中發(fā)生的一系列自由基反應(yīng)，它一方面使脂質(zhì)含量較高的生物膜受到損傷，引起溶酶體顆粒崩潰，造成細胞死亡;另一方面使膜失去作為區(qū)域化的功能，導(dǎo)致按功能需要排列的酶紊亂。SOD則是氧自由基有效的清除劑，對機體的氧化與抗氧化平衡起著極其重要的作用。SOD是需氧生物體內(nèi)的一種含不同金屬離子的酶蛋白，其主要作用是清除體內(nèi)有毒性的氧自由基，阻斷由超氧陰離子自由基所激發(fā)的一系列自由基反應(yīng)，有保護細胞免受自由基損害的作用［7］。因此，在機體滅活自由基的抗氧化體系中，SOD具有重要作用。SOD是機體內(nèi)催化超氧陰離子自由基發(fā)生歧化反應(yīng)的重要酶類，在防御炎癥、化學(xué)中毒及腫瘤發(fā)生等方面起重要作用，而MDA是脂質(zhì)過氧化的重要降解產(chǎn)物，可反映過氧化的過程。

本研究顯示內(nèi)毒素休克組血漿MDA水平較對照組顯著升高(P＜0．01)，SOD水平明顯下降(P＜0．01);LXA4組血漿MDA水平較B組顯著降低(P＜0．01)，SOD 水平明顯上升(P ＜0．01)。表明內(nèi)毒素休克狀態(tài)機體抗自由基能力減弱，不能產(chǎn)生足夠的SOD，生物膜的損傷加劇，從而MDA含量增多。

綜上所述，LXA4預(yù)處理可明顯提高內(nèi)毒素休克大鼠的存活時間，提高內(nèi)毒素休克大鼠血漿抗炎性介質(zhì)(IL－10、SOD)的水平，降低促炎性介質(zhì)(TNF－α)的水平，對維持機體炎癥介質(zhì)/抗炎介質(zhì)的平衡具有重要作用。

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