王冬蘭, 簡 秋, 柯昌杰, 宋穩(wěn)成, 孫 星, 汪佳蕾, 楊邦保
(1.農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全控制技術(shù)與標(biāo)準(zhǔn)重點實驗室,農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險評估實驗室(南京),江蘇 南京 210014;2.農(nóng)業(yè)部農(nóng)藥檢定所,北京 100125)
葡萄是世界“四大果樹”之一,也是重要果樹種類[1]。中國葡萄生產(chǎn)發(fā)展速度居國內(nèi)果品之首[2],截至2010年底,葡萄栽培總面積5.2×104hm2,居第6位,僅次于柑橘、蘋果、梨、桃和荔枝[3];總產(chǎn)量8.548 9×106t,居第6位,僅次于蘋果、柑橘、梨、桃和香蕉[4]。隨著國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系的啟動與實施,中國在葡萄栽培種植科研方面取得了較大進(jìn)展,有力地推動了葡萄產(chǎn)業(yè)的健康可持續(xù)發(fā)展。由于葡萄種植具有生長周期長、病蟲害種類多等特點,因此農(nóng)藥殘留是影響葡萄質(zhì)量安全與消費(fèi)者健康的主要因素之一。嘧菌環(huán)胺為嘧啶胺類內(nèi)吸性殺菌劑,主要是在病原真菌的侵入期和菌絲生長期施用,通過抑制蛋氨酸的生物合成和水解酶的生物活性,導(dǎo)致病菌死亡。嘧菌環(huán)胺可迅速被植物葉面吸收,具有較好的保護(hù)性和治療活性,可防治谷物、蔬菜和水果等多種作物的灰霉?。?-8]。目前中國尚未制定嘧菌環(huán)胺在葡萄中的最大殘留限量標(biāo)準(zhǔn)值(MRL),國際食品法典委員會(CAC)制定其在葡萄中的MRL值為3 mg/kg。本試驗擬開展嘧菌環(huán)胺在葡萄上的殘留規(guī)律研究,為制定其在葡萄上的最大殘留限量標(biāo)準(zhǔn)提供評價數(shù)據(jù),指導(dǎo)該藥在葡萄生產(chǎn)中的合理使用。
1.1.1 主要儀器 Agilent-1200型液相色譜儀 (配有 DAD檢測器),色譜柱為 Agilent extend-C18柱(4.6 mm ×150 mm,5 μm)。
1.1.2 試劑 甲醇、乙腈為色譜純;超純水為標(biāo)準(zhǔn)品(純度>95%,德國ACROS公司產(chǎn)品);N-丙基乙二胺鍵合固相吸附材料(PSA)購于DIMA Technology Inc.Richmond Hill,USA;無水硫酸鎂(北京化學(xué)試劑公司產(chǎn)品)在500℃馬弗爐中烘5 h;嘧菌環(huán)胺標(biāo)準(zhǔn)品購于德國Dr.Ehrenstorfer公司,純度98%;50%嘧菌環(huán)胺水分散粒劑為市售。
1.1.3 標(biāo)樣的配制 精確稱取嘧菌環(huán)胺標(biāo)準(zhǔn)品(精確至0.1 mg),甲醇定容至50.0 ml,配成標(biāo)準(zhǔn)母液。再用空白葡萄和土壤的提取液配制成0.02 mg/L、0.05 mg/L、0.10 mg/L、0.25 mg/L、0.50 mg/L、1.00 mg/L系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液。配制好的標(biāo)準(zhǔn)工作液置于4℃冰箱中備用。
按照《農(nóng)藥登記殘留田間試驗標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程》[9],于2012年分別在北京市、江蘇省南京市、山東省煙臺市3個試驗點進(jìn)行殘留試驗。各試驗點分別設(shè)葡萄低劑量(800 mg/kg,a.i.)、葡萄高劑量(1 200 mg/kg,a.i.)兩個施藥劑量。每個劑量再設(shè)施藥3次、4次(間隔7 d施藥1次)2個施藥次數(shù)。同時設(shè)葡萄殘留消解動態(tài)和土壤消解動態(tài)2個試驗,均為1 200 mg/kg,a.i.,各施藥1次,每個處理3次重復(fù),每小區(qū)面積20 m2,用于殘留動態(tài)試驗的葡萄系繩標(biāo)記,同時設(shè)不施藥對照小區(qū)。
最終殘留試驗處理中葡萄和土壤樣品的采收:在最后一次施藥后7 d、14 d和21 d后,隨機(jī)在試驗小區(qū)內(nèi)不同方向及上下不同部位采集6串以上(不少于2 kg)生長正常、無病害、成熟的葡萄;同時用土壤采樣器在試驗小區(qū)內(nèi)隨機(jī)選6~12采樣點,采集地表以下0~15 cm土壤。
葡萄殘留消解動態(tài)試驗處理中葡萄樣品的采收:于施藥后 0 d(2 h)、1 d、3 d、5 d、7 d、10 d、14 d和21 d采用隨機(jī)方法在試驗小區(qū)內(nèi)不同方向及上下不同部位采集6串以上生長正常、無病害、成熟的系繩標(biāo)記過的葡萄(不少于2 kg)。
土壤殘留消解動態(tài)試驗處理中土壤樣品的采收:于施藥后 0 d(2 h)、1 d、3 d、5 d、7 d、10 d、14 d和21 d隨機(jī)選10點以上用土壤取樣器取0~10 cm深土樣1 kg左右。
將采集到的葡萄樣本用搗碎機(jī)搗碎,裝入密封袋中,貯存于-20℃冰箱內(nèi)待分析。將采集到的土壤樣本混合均勻,貯存于-20℃冰箱內(nèi)待分析。
1.4.1 提取方法 稱取搗碎的葡萄樣本15.0 g或土壤樣本10.0 g于離心管中,加入乙腈15 ml,渦旋振蕩1 min,然后加入1.5 g NaCl和6 g MgSO4渦旋1 min,4 000 r/min離心 5 min,取上層清液 1 ml到稱有150 mg無水MgSO4和50 mg PSA的2 ml離心管中,渦旋30 s,取500 μl上清液過 0.22 μm 濾膜到自動進(jìn)樣瓶中,待測[10-12]。
1.4.2 液相色譜檢測條件 流動相:使用梯度洗脫模式,甲醇∶水=60∶40(體積比),保持1 min,在1~15 min變換到甲醇∶水=70∶30(體積比),保持20 min。檢測器波長:270 nm;流速:1.0 ml/min;進(jìn)樣量:20 μl[10-12]。
采用保留時間定性,外標(biāo)法峰面積定量。分別在空白葡萄或土壤樣品中添加不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的嘧菌環(huán)胺標(biāo)樣(0.05 mg/kg、0.10 mg/kg、1.00 mg/kg),按上述提取、凈化和儀器分析步驟進(jìn)行測定,每個添加水平重復(fù)5次。嘧菌環(huán)胺相對保留時間為12.7 min左右。添加回收試驗結(jié)果表明,嘧菌環(huán)胺在葡萄中平均回收率為81.1%~92.6%,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.8% ~9.0%;在土壤中平均回收率為80.1% ~91.8%,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.0% ~9.7%(表1)。該方法對葡萄和土壤中嘧菌環(huán)胺殘留的最低檢出限均為0.05 mg/kg。該方法符合NY/T 788—2004《農(nóng)藥殘留試驗準(zhǔn)則》的要求[13]。
表1 嘧菌環(huán)胺在葡萄和土壤中的添加回收率(n=5)Table 1 Recoveries of cyprodinil in grape and soil(n=5)
嘧菌環(huán)胺在北京市、江蘇省南京市和山東省煙臺市3個不同試驗點葡萄和土壤中的殘留消解動態(tài)見圖1,降解動力學(xué)方程見表2。嘧菌環(huán)胺在葡萄和土壤樣品中的降解計算采用一級動力學(xué)方程式(Ct=C0e-kt)[14-15]。試驗結(jié)果表明,在施藥當(dāng)天,嘧菌環(huán)胺在各試驗點葡萄中的殘留量為1.16~2.43 mg/kg,在土壤中的殘留量為0.85~4.21 mg/kg,隨著采樣時間的延長,葡萄中嘧菌環(huán)胺的含量均降低。嘧菌環(huán)胺在不同試驗點葡萄中的原始沉積量差異較大(北京:2.43 mg/kg;江蘇:1.16 mg/kg;山東:1.84 mg/kg)。由葡萄品種不同而引起的葡萄表面積差異能導(dǎo)致農(nóng)藥在葡萄上的殘留量有明顯差異,由不同試驗點的葡萄種植密度不同而導(dǎo)致的農(nóng)藥用量不同也能引起農(nóng)藥在葡萄上殘留量出現(xiàn)差異。同時,施藥的天氣條件,如溫度、相對濕度、風(fēng)速等也能導(dǎo)致嘧菌環(huán)胺在不同試驗點葡萄上原始沉積量存在差異。施藥后5 d,嘧菌環(huán)胺在3個試驗點葡萄中的降解率均達(dá)到50%以上。施藥后14 d,嘧菌環(huán)胺在葡萄中的降解率均達(dá)到了90%以上。施藥后5 d,嘧菌環(huán)胺在3個試驗點種植葡萄土壤中降解率也均超過了80%。從表2可以看出,嘧菌環(huán)胺在山東省煙臺市試驗點葡萄中的半衰期最長(4.2 d),在江蘇省南京市試驗點葡萄中的半衰期最短(1.7 d)。嘧菌環(huán)胺在北京試驗點土壤中的半衰期最長(4.1 d),在江蘇南京試驗點土壤中的半衰期最短(3.1 d)。
表2 嘧菌環(huán)胺在葡萄和土壤中的消解動力學(xué)方程Table 2 Degradation equations of cyprodinil in grape and soil
圖1 嘧菌環(huán)胺在葡萄和土壤中的殘留消解動態(tài)Fig.1 Degradation dynamics of cyprodinil in grape and soil
按低劑量、高劑量分別施藥3次和4次后,在距最后一次施藥7 d、14 d和21 d時葡萄和土壤樣品中嘧菌環(huán)胺殘留量見表3和表4。嘧菌環(huán)胺在葡萄中的殘留量為 0.05~3.85 mg/kg。低劑量和高劑量施藥3次和4次處理,在最后一次施藥后21 d,葡萄中嘧菌環(huán)胺均低于2 mg/kg(美國限量標(biāo)準(zhǔn))。在相同施藥劑量和施藥次數(shù)條件下,隨著采樣間隔期的延長,各試驗點葡萄中嘧菌環(huán)胺的殘留量隨之下降;在相同采收間隔期和施藥次數(shù)條件下,各試驗點高劑量處理葡萄中嘧菌環(huán)胺的殘留量均高于低劑量處理;在相同采收間隔期和施藥劑量條件下,各試驗點葡萄中嘧菌環(huán)胺的殘留量隨著用藥次數(shù)的增加而增加。種植葡萄地的土壤中嘧菌環(huán)胺的含量為0.11 ~3.21 mg/kg。
表3 嘧菌環(huán)胺在葡萄中的最終殘留量Table 3 Final residue levels of cyprodinil in grape
表4 嘧菌環(huán)胺在土壤中的最終殘留量Table 4 Final residue levels of cyprodinil in soil
嘧菌環(huán)胺是一種蛋氨酸生物合成抑制劑,與三唑類、咪唑類、嗎啉類、苯基吡咯類等無交互抗性,具有預(yù)防和治療作用。目前在中國已有7個農(nóng)藥產(chǎn)品取得了臨時登記,每日允許攝入量(ADI)為0.03 mg/(kg·bw)。目前中國尚未制定相關(guān)農(nóng)產(chǎn)品中嘧菌環(huán)胺的最大殘留限量(MRL)。CAC殘留限量標(biāo)準(zhǔn)中嘧菌環(huán)胺在葡萄上的MRL值均為3 mg/kg,日本為5 mg/kg,美國為2 mg/kg。為保障消費(fèi)者的安全和促進(jìn)貿(mào)易,有必要研究嘧菌環(huán)胺在中國不同典型葡萄種植區(qū)域的殘留規(guī)律和最終殘留量,為盡快制定其在相關(guān)作物上的MRL及評估殘留風(fēng)險提供理論依據(jù)。
本研究所建立的葡萄和土壤中嘧菌環(huán)胺殘留分析方法檢出限(0.05 mg/kg)低,前處理方法簡便且效率高,完全能夠滿足市場監(jiān)測和農(nóng)藥登記殘留試驗中嘧菌環(huán)胺殘留的檢測。嘧菌環(huán)胺按高低兩個施藥劑量,分別施藥3次和4次,21 d后采樣,葡萄中嘧菌環(huán)胺殘留量均低于 2 mg/kg,參照 CAC(3 mg/kg)、美國(2 mg/kg)和日本(5 mg/kg)制定的葡萄中嘧菌環(huán)胺的MRL,按本試驗中劑量施藥21 d后采收葡萄是安全的。
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