血清非羧化MGP蛋白在強(qiáng)直性脊柱炎中的表達(dá)及意義

黃漢清，朱立新，李留洋，錢俊，王坤

血清非羧化MGP蛋白在強(qiáng)直性脊柱炎中的表達(dá)及意義

黃漢清，朱立新，李留洋，錢俊，王坤

目的探討強(qiáng)直性脊柱炎(AS)患者血清非羧化MGP蛋白(ucMGP)的水平及其診斷價(jià)值，了解ucMGP與AS炎癥及骨化病程的關(guān)系。方法選擇2010年1月－2012年7月珠江醫(yī)院收治的82例AS患者作為AS組，同期75例健康體檢者作為對照組。評估AS患者各項(xiàng)臨床指標(biāo)(年齡、性別、病程、疾病活動(dòng)度)、影像學(xué)進(jìn)展以及反映骨代謝或炎癥的指標(biāo)[紅細(xì)胞沉降率(ESR)、C反應(yīng)蛋白(CRP)、骨鈣素(OC)、骨堿性磷酸酶(BALP)]。疾病活動(dòng)度依據(jù)BASDAI評分標(biāo)準(zhǔn)，影像學(xué)進(jìn)展以mSASSS評分標(biāo)準(zhǔn)為依據(jù)。采用競爭性ELISA法檢測AS患者血清ucMGP濃度。利用ROC曲線分析ucMGP診斷AS的價(jià)值。運(yùn)用相關(guān)分析法分析ucMGP與疾病活動(dòng)度、影像進(jìn)展、骨代謝及炎癥生物標(biāo)志的關(guān)系。結(jié)果AS組ESR及血清CRP水平高于對照組，但ucMGP濃度(2958±654nmol/L)低于對照組(4551±1036nmol/L，P＜0.01)。ROC曲線分析顯示，ucMGP=3859nmol/L(截?cái)帱c(diǎn))時(shí)的診斷特異性及敏感性分別為69.7%、91.5%，Youden指數(shù)為0.612，曲線下面積(AUC)為0.825，其診斷效力為中級。相關(guān)分析顯示，血清ucMGP水平與ESR、CRP、BALP、OC以及BASDAI評分無明顯相關(guān)性。影像學(xué)mSASSS評分與ucMGP水平呈顯著負(fù)相關(guān)(r=－0.715，P＜0.01)，當(dāng)mSASSS＞0、1、10時(shí)，r分別為－0.715、－0.741、－0.776(P＜0.01)，當(dāng)mSASSS＜10時(shí)，r=－0.297(P=0.028)，相關(guān)性不明顯。結(jié)論AS患者血清ucMGP可作為一種新的血清診斷指標(biāo)及反映骨化進(jìn)展的生物標(biāo)志，尤其是在AS骨化病程后期。

Gla蛋白，基質(zhì)，非羧化；脊柱炎，強(qiáng)直性；骨化

強(qiáng)直性脊柱炎(ankylosing spondylitis，AS)是一種以附著點(diǎn)炎及韌帶骨贅形成為主要病理特征的慢性進(jìn)展性炎性疾病，最終導(dǎo)致進(jìn)展性脊柱強(qiáng)直及活動(dòng)受限[1]。盡管韌帶骨贅形成代表骨質(zhì)增生，但目前研究顯示大部分AS患者尤其是晚期患者表現(xiàn)為骨密度下降[2]。因此，X線片以及能夠反映骨及軟骨代謝的指標(biāo)對于檢測AS的疾病活動(dòng)情況、骨質(zhì)疏松或者骨質(zhì)改變具有重要意義。為量化AS的病理進(jìn)程，可對傳統(tǒng)X線片進(jìn)行影像評分以評價(jià)骨組織的改變情況[3]。在目前常用的X線片影像評分系統(tǒng)中，mSASSS(modified Stoke Ankylosing Spondylitis Spine Score)被認(rèn)為具有較高的臨床應(yīng)用價(jià)值[4]?；|(zhì)Gla蛋白(matrix Gla protein，MGP)是一種分子量為14kD的低分子胞外基質(zhì)蛋白，因含有5個(gè)可羧化γ-谷氨酸殘基而得名[5]，另外還帶有多個(gè)可磷酸化的絲氨酸殘基[6]。MGP主要由軟骨細(xì)胞[7]及血管平滑肌細(xì)胞分泌[8]，可以抑制血管鈣化[9]及軟骨成骨分化。MGP活性決定于羧化的γ-谷氨酸殘基，其羧化過程具有維生素K依賴性[10]。MGP的羧化或者磷酸化使血液中存在多種MGP分子形式，其中非羧化MGP蛋白被稱為ucMGP。目前尚未見關(guān)于AS患者血清或局部MGP蛋白水平的大樣本臨床研究。Silaghi等[11]研究發(fā)現(xiàn)，關(guān)節(jié)炎患者群體(包括5例AS患者)總體上表現(xiàn)出關(guān)節(jié)液與血液中ucMGP的分布異常。AS骨贅形成主要以軟骨化骨的方式進(jìn)行，推測MGP可能在AS的骨化過程中發(fā)揮負(fù)性調(diào)節(jié)作用。為此本研究觀察AS患者的血清ucMGP水平，及其與AS相關(guān)的臨床指標(biāo)如BASDAI(bath AS disease activity index)，影像評分(mSASSS)，血清中炎癥指標(biāo)如紅細(xì)胞沉降率(ESR)、C反應(yīng)蛋白(CRP)水平等，骨代謝指標(biāo)如骨堿性磷酸酶(BALP)、骨鈣素(OC)等的關(guān)系，以期為AS的臨床診斷提供新的思路。

1 資料與方法

1.1病例資料 選擇2010年1月－2012年7月珠江醫(yī)院收治的82例AS患者及同期75例健康體檢者加入隨機(jī)對照研究。AS患者均符合修改的紐約診斷標(biāo)準(zhǔn)(1984年)[12]，盡量避免因病情活動(dòng)造成的選擇偏倚。排除具有心血管疾病、慢性腎臟疾病、感染、其他風(fēng)濕性疾病，以及正使用抗腫瘤壞死因子生物制劑，維生素K及其拮抗劑如華法林，維生素D等的患者。對照組來自健康體檢人群，無心血管疾病、肝腎疾病、風(fēng)濕性疾病、炎癥及感染，未服用維生素K及其拮抗劑、維生素D。納入研究的AS患者及健康對照均能提供研究所涉及的各項(xiàng)臨床資料及檢測結(jié)果，否則予以排除。

1.2臨床評估 收集AS患者及健康對照的臨床資料，包括一般臨床資料[年齡、性別、病程、體重指數(shù)(BMI)]，HLA-B27表型，影像學(xué)資料(頸椎及腰椎側(cè)位X線片)，ESR(Westergren 法)，CRP濃度(免疫比濁法測定)。參照BASDAI評分標(biāo)準(zhǔn)[13]設(shè)計(jì)隨訪問卷(0－10分)，獲得每例患者的BASDAI評分。由3位具有影像專業(yè)知識背景的醫(yī)師對患者脊柱雙側(cè)側(cè)位X線片進(jìn)行獨(dú)立閱片，按照mSASSS標(biāo)準(zhǔn)[4]進(jìn)行評分，最終分值為3位醫(yī)師評分的平均值。

1.3血清保存及檢測 抽取AS患者及健康對照的靜脈血，置于真空非抗凝管，30min內(nèi)迅速保存于－20℃，并在1個(gè)月內(nèi)通過離心(2400×g，10min)獲取上層血清后轉(zhuǎn)移到－80℃長期保存。BALP、OC濃度檢測采用ELISA法，具體操作按照試劑盒(NovaTeinBio，USA)說明書進(jìn)行。ucMGP濃度檢測采用競爭ELISA法。以帶有生物素標(biāo)記的ucMGP多肽序列(ucMGP35-54)的人工合成類似物(Pepscan，Leylystad，Netherlands)作為標(biāo)準(zhǔn)品，該多肽序列帶生物素標(biāo)記后(biotinylated ucMGP 35–54，b-ucMGP35–54)則作為競爭抗原。具體檢測過程如下：多克隆兔抗鼠IgG抗體以0.1mol/L碳酸鹽溶液(pH9.6)稀釋2000倍后，鋪板(100μl/孔)，37℃孵育1.5h，10%小牛血清封閉(200μl/L)，室溫下孵育2h。微孔板洗板5次，加入100μl針對ucMGP Gla結(jié)構(gòu)域(35－54序列)的單克隆抗體(mAb-ucMGP；VitaK BV，Maastricht，Netherlands)，37℃孵育過夜，洗板5次。取5μl標(biāo)準(zhǔn)品或血清樣品加入70μl PBS-Tween 20緩沖液稀釋，取20μl稀釋后的標(biāo)準(zhǔn)品或血清樣品與100μl b-ucMGP35–54 (0.7μg/ml)混合。取100μl上述混合液加入微孔板，4℃孵育過夜。洗板3次后，加入稀釋10 000倍的鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化酶(streptavidin-peroxide)100μl，37℃孵育0.5～1h，洗板5次，加入100μl TMP顯色，加入50μl 1mol/L H2SO4，450nm光譜下讀板。通過標(biāo)準(zhǔn)品曲線計(jì)算ucMGP濃度。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以±s表示，組間比較采用Mann-Whitney U檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)。通過ROC曲線(receiver operating characteristic curve)分析確定ucMGP作為AS診斷指標(biāo)的截?cái)帱c(diǎn)，并確定其在該點(diǎn)的診斷特異性、敏感性、曲線下面積(AUC)、Youden指數(shù)。診斷效力評級：AUC≤0.7為低級，0.7＜AUC＜0.9為中級，AUC≥0.9為高級。ucMGP水平與臨床及血清指標(biāo)的關(guān)系分析采用Spearman秩相關(guān)法。P＜0.01為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1AS患者與健康對照臨床資料、血清炎癥及骨代謝相關(guān)指標(biāo)的比較 AS組年齡、性別、BMI、BALP、OC等指標(biāo)與對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但ESR及CRP水平明顯高于對照組，而血清ucMGP濃度明顯低于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01，表1)。

2.2血清ucMGP作為AS診斷指標(biāo)的最佳截?cái)帱c(diǎn)及診斷價(jià)值 ROC曲線分析顯示，ucMGP診斷AS的界值(最佳截?cái)帱c(diǎn))為3859nmol/L，此時(shí)可獲得最優(yōu)化的診斷特異性(69.7%)及敏感性(91.5%)組合，Youden指數(shù)為0.612，AUC為0.825(圖1)，診斷效力可評為中級。

表1 臨床指標(biāo)和血清生物學(xué)標(biāo)記的比較Tab. 1 Comparison of clinical parameters and serum

圖1 血清ucMGP濃度水平作為診斷指標(biāo)的ROC曲線分析Fig. 1 ROC curve analysis based on ucMGP level as diadynamic criteria

2.3AS患者血清ucMGP濃度與各指標(biāo)的相關(guān)性Spearman相關(guān)分析顯示，AS患者血清ucMGP濃度與ESR、CRP、BALP、OC、BASDAI評分均無明顯相關(guān)性(P＞0.05)，但與頸椎及腰椎側(cè)位X線片mSASSS評分呈顯著負(fù)性相關(guān)(r=－0.715，P＜0.01)。繪制ucMGP-mSASSS散點(diǎn)圖(圖2)并進(jìn)行分區(qū)間分析顯示，分別取mSASSS＞0、1、10時(shí)，Spearman相關(guān)系數(shù)r分別為－0.715、－0.741、－0.776，P值均小于

圖2 ucMGP血清濃度值與mSASSS 評分關(guān)聯(lián)性特征散點(diǎn)圖Fig. 2 Relevance between mSASSS score and serum ucMGP concentration

3 討 論

本研究通過前瞻性對照發(fā)現(xiàn)AS患者血清ucMGP水平明顯低于健康對照人群，其均值僅為對照組的65%，而Silaghi等[11]的研究報(bào)道5例AS患者血清ucMGP低于對照組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。為了解ucMGP對AS的診斷價(jià)值，本研究利用ROC曲線分析，結(jié)果顯示，以ucMGP=3859nmol/L作為界值診斷AS的特異性及敏感性分別為69.7%、91.5%，Youden指數(shù)為0.612，AUC為0.825，診斷價(jià)值為中級。而ucMGP診斷AS的特異性較低，考慮與多種疾病如心血管疾病、慢性腎衰竭、類風(fēng)濕等有關(guān)，維生素K、D等的攝入也可能影響其濃度，即使在研究設(shè)計(jì)時(shí)將上述疾病納入排除標(biāo)準(zhǔn)，但由于疾病早期臨床常難以鑒別，因此可能對實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成一定影響。ucMGP通過ELISA試劑盒即可檢測，相對于HLA-B27需采用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行測定，成本更低，檢測速度更快，如果與HLA-B27結(jié)合將有望提高AS的診斷率。

為了解MGP蛋白在AS病理過程中的作用，本研究對其與AS炎癥及骨代謝指標(biāo)的關(guān)系進(jìn)行了分析，結(jié)果顯示AS患者CRP、ESR明顯偏高，而其他指標(biāo)與對照組比較無明顯差異，且CRP、ESR、BALP、OC、BASDAI等與ucMGP無明顯相關(guān)性。既往研究顯示，AS患者的CRP、ESR、BASDAI與其活動(dòng)期炎癥過程密切相關(guān)[14-15]，但反映AS的病理骨化進(jìn)程不敏感[15]。本研究顯示ucMGP與CRP、ESR、BASDAI無明顯相關(guān)，亦提示其與AS活動(dòng)期炎癥的聯(lián)系并不緊密。雖然BALP、OC與ucMGP無顯著相關(guān)，但不能因此確定ucMGP未參與AS的骨化過程，因?yàn)锽ALP、OC雖然可很好地反映成骨代謝水平[16]，但對AS的病理性骨化過程并不敏感[15,17]。

本研究采用mSASSS評分系統(tǒng)對AS患者的影像學(xué)進(jìn)展進(jìn)行量化評分，結(jié)果顯示血清ucMGP濃度與mSASSS評分呈顯著負(fù)相關(guān)，散點(diǎn)圖觀察及分區(qū)間分析顯示，隨著mSASSS評分增加，二者的關(guān)聯(lián)性增強(qiáng)。mSASSS是目前評價(jià)AS脊柱骨化進(jìn)展最敏感的影像指標(biāo)，其值越高表明AS骨化程度越嚴(yán)重，因此本研究結(jié)果提示血清ucMGP濃度可作為反映AS骨化程度的指標(biāo)，尤其是在AS病程后期。

既往研究顯示MGP蛋白對于異位骨化[18]及軟骨化骨[19]具有負(fù)性調(diào)節(jié)作用，其抑制鈣化及骨化的機(jī)制包括：①與鈣離子結(jié)合清除組織中富余的鈣離子[20]，或與鈣鹽晶體結(jié)合阻止羥基磷灰石晶體形成[21]；②抑制BMP-2的成骨活性，以調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞成熟及成骨分化[12]。因此，對于AS患者血清ucMGP濃度降低，我們認(rèn)為是由于ucMGP易聚集于AS骨化活躍的病灶處，并可能在骨化病程中扮演負(fù)性調(diào)節(jié)角色，骨化越嚴(yán)重，ucMGP在局部的聚集越明顯，從而循環(huán)ucMGP的濃度越低。但該觀點(diǎn)尚需要病理學(xué)研究支持。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)，AS患者血清ucMGP可作為一種新的診斷指標(biāo)及反映骨化進(jìn)展的生物學(xué)標(biāo)志物，尤其是在AS骨化病程后期。

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Expression of uncarboxylated matrix Gla protein in ankylosing spondylitis and its significance

HUANG Han-qing1, ZHU Li-xin1*, LI Liu-yang2, QIAN Jun2, WANG Kun1
1Department of Orthopedics,
2Department of Organ Transplantation, Zhujiang Hospital, South Medical University, Guangzhou 510280, China
*

, E-mail: zhulixin1966@163.com

ObjectiveTo investigate the serum level of uncarboxylated matrix Gla protein (ucMGP) in ankylosing spondylitis (AS) patients, and to evaluate its diagnostic value and the relation of ucMGP to inflammation and ossification process in AS.MethodsEight-two AS patients and 76 healthy controls were enrolled in this randomized controlled study. The clinical indices (age, gender, course of disease, disease activity), changes in radiographic studies, and indices of bone metabolism or inflammation, including erythrocyte sedimentation rate (ESR), C-reactive protein (CRP), osteocalcin (OC), and bone-specific alkaline phosphatase (BALP) were evaluated or measured. The disease activity was assessed by Bath Ankylosing Spondylitis Disease Activity Index (BASDAI), and changes in radiographic pictures were evaluated according to the modified Stoke AS Spine Score (mSASSS), and serum level of ucMGP was measured by a competitive ELISA. The relationship between ucMGP and clinical indexes, radiographic scoring, indices in bone metabolism or inflammation was estimated by SPSS software, and the diagnostic value of ucMGP was analyzed by receiver operator characteristic (ROC) curve.ResultsThe levels of ESR and CRP in AS patients were higher than those in healthy controls, but the serum ucMGP was lower (2958±654nmol/L) compared with healthy controls (4551±1036nmol/L,P＜0.01). ROC analysis revealed that the diagnostic specificity and sensitivity of ucMGP was 91.5% and 69.7% with a cut-off of 3859nmol/L (Youden index 0.612, AUC 0.825, 95% CI 0.758-0.891), and the diagnostic validity was moderate. There was no significant correlation between ucMGP and ESR, CRP, BALP, OC, BASDAI score. There was a significant negative correlation between the radiographic progression of the lesion and serum ucMGP (r=－0.715,P＜0.01). This correlation was stronger when radiographic scores rose (mSASSS＞0, r=－0.715,P＜0.01; mSASSS ＞1, r=－0.741,P＜0.01; mSASSS ＞10, r=－0.776,P＜0.01; mSASSS ＜10, r=－0.297, P=0.028).ConclusionSerum ucMGP may serve as a diagnostic biomarker of AS and progression index of ossification, especially in late stage of AS.

Gla protein, matrix, uncarboxylated; spondylitis, ankylosing; ossification

R593.23

A

0577-7402(2013)06-0489-04

2012-12-20；

2013-04-22)

(責(zé)任編輯：胡全兵)

黃漢清，醫(yī)學(xué)碩士。主要從事骨科的基礎(chǔ)與臨床研究

510280 廣州 南方醫(yī)科大學(xué)附屬珠江醫(yī)院骨科(黃漢清、朱立新、王坤)，器官移植科(李留洋、錢俊)

朱立新，E-mail：zhulixin1966@163.com