白藜蘆醇對血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的血管平滑肌細胞增殖的抑制作用及其機制觀察

郜攀，司良毅，徐強，王笑梅

白藜蘆醇對血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的血管平滑肌細胞增殖的抑制作用及其機制觀察

郜攀，司良毅，徐強，王笑梅

目的探討白藜蘆醇對血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)誘導(dǎo)的血管平滑肌細胞(VSMCs)增殖的影響及其可能機制。方法體外培養(yǎng)大鼠胸主動脈血管平滑肌細胞(VSMCs)。在檢測白藜蘆醇影響AngⅡ誘導(dǎo)VSMCs增殖和活力的實驗中，將細胞分為對照組、AngⅡ組(1μmol/L)、白藜蘆醇濃度梯度(10、30、100μmol/L)組及AngⅡ+白藜蘆醇濃度梯度組，各組細胞均反應(yīng)0、6、12、24h，采用細胞計數(shù)法檢測VSMCs增殖情況，MTT法檢測VSMCs活力。在檢測腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)抑制劑復(fù)合物C對VSMCs生物活性影響的實驗中，將細胞分為對照組、AngⅡ組、白藜蘆醇+AngⅡ組及復(fù)合物C組+白藜蘆醇+AngⅡ組，各組細胞反應(yīng)24h后采用Western blotting檢測增殖細胞核抗原(PCNA)蛋白表達。結(jié)果與對照組比較，6、12、24h后AngⅡ組細胞活力和細胞數(shù)目均顯著增高(P＜0.05)；與AngⅡ組比較，不同濃度白藜蘆醇+AngⅡ組細胞活力和細胞數(shù)目均顯著降低(P＜0.05)。另一方面，與對照組比較，AngⅡ組PCNA蛋白表達顯著增高(P＜0.05)；與AngⅡ組比較，白藜蘆醇+AngⅡ組PCNA蛋白表達顯著降低(P＜0.05)；而與白藜蘆醇+AngⅡ組比較，復(fù)合物C+白藜蘆醇+AngⅡ組細胞數(shù)目、細胞活力及PCNA蛋白表達顯著增高(P＜0.05)。結(jié)論白藜蘆醇可抑制AngⅡ誘導(dǎo)的VSMCs增殖，其機制可能與AMPK的激活有關(guān)。

白藜蘆醇；肌細胞，平滑??；血管緊張素Ⅱ；腺苷酸活化蛋白激酶

動脈粥樣硬化是眾多心腦血管疾病發(fā)展的基礎(chǔ)。研究提示，炎癥因子刺激血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)表型轉(zhuǎn)換和異常增殖進而導(dǎo)致血管重構(gòu)是動脈粥樣硬化發(fā)生的重要病理基礎(chǔ)[1-2]。近年來，紅酒中的天然提取物白藜蘆醇(resveratrol)在心血管疾病中的保護作用逐漸受到關(guān)注，相關(guān)研究表明白藜蘆醇能夠抑制VSMCs增殖，但其作用機制尚未闡明[3-4]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇能激活內(nèi)皮細胞腺苷酸活化蛋白激酶(adenosine monophosphate-activated protein kinase，AMPK)，誘導(dǎo)一氧化氮釋放、改善內(nèi)皮功能，提示AMPK對細胞功能具有重要影響[5]。血管緊張素Ⅱ(angiotensin Ⅱ，AngⅡ)是腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(RAAS)中最重要的一種生物活性肽，除有收縮血管、促醛固酮分泌及心肌肥大[6]等作用外，還具有很強的促VSMCs增殖作用，同時AngⅡ是VSMCs分泌的一種重要炎癥介質(zhì)，除誘導(dǎo)血管平滑肌細胞增殖之外，還可促進炎癥介質(zhì)釋放，導(dǎo)致動脈粥樣硬化發(fā)生[7]。因此觀察白藜蘆醇與VSMCs內(nèi)AngⅡ的相互作用，進而探討其相互作用機制對理解白藜蘆醇在心血管系統(tǒng)中的保護作用具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 動物及試劑 清潔級SD大鼠購自第三軍醫(yī)大學(xué)動物實驗中心。白藜蘆醇、血管緊張素Ⅱ、復(fù)合物C(AMPK抑制劑)均購自Sigma公司(美國)；細胞計數(shù)試劑盒及MTT試劑盒購買自北京鼎國重慶分公司；SM-actin蛋白、增殖細胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)蛋白、β-actin蛋白一抗購自Santa Cruz公司(美國)；兔抗山羊二抗購自北京中杉金橋生物公司。

1.2 原代VSMCs的培養(yǎng)和鑒定[8]組織貼塊法培養(yǎng)大鼠胸主動脈VSMCs。倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態(tài)及生長狀況。采用SM-actin免疫熒光法對VSMCs進行細胞鑒定，陽性表達為胞質(zhì)呈細顆粒狀綠色沉淀反應(yīng)。

1.3 細胞分組 選擇第3～5代VSMCs進行實驗。胰蛋白酶消化制備細胞懸液，調(diào)整細胞密度為5.0×107/L，接種于培養(yǎng)板備用。在37℃、5%CO2條件下經(jīng)10%胎牛血清預(yù)培養(yǎng)24h和0.5%胎牛血清預(yù)處理12h后進行分組。在檢測白藜蘆醇對AngⅡ誘導(dǎo)的VSMCs增殖和細胞活力的影響作用實驗中，將細胞隨機分為對照組(不加特殊處理因素)、AngⅡ組(1μmol/L AngⅡ處理)、不同濃度白藜蘆醇組(10、30、100μmol/L白藜蘆醇處理)、不同濃度白藜蘆醇+AngⅡ組(1μmol/L AngⅡ+10、30、100μmol/L白藜蘆醇處理)，各組細胞反應(yīng)0、6、12、24h后進行檢測。在檢測復(fù)合物C對VSMCs生物活性影響的實驗中，將細胞隨機分為對照組、AngⅡ組(1μmol/ L AngⅡ處理)、白藜蘆醇+AngⅡ組(1μmol/L AngⅡ和100μmol/L白藜蘆醇處理)和復(fù)合物C+白藜蘆醇+AngⅡ組(以1μmol/L復(fù)合物C預(yù)處理細胞24h后，再加入100μmol/L白藜蘆醇+1μmol/L AngⅡ)，各組細胞反應(yīng)24h后進行檢測。

1.4 細胞計數(shù)[9]VSMCs培養(yǎng)24h后換用含0.5%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液同步化24h。按實驗分組換用含不同干擾因素及10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。分別在給予干擾因素后0、6、12、24h計數(shù)各組細胞。實驗重復(fù)3次，每次計數(shù)3個復(fù)孔。

1.5 MTT法檢測細胞活力[10]按每孔1×103個細胞接種于96孔板，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)24h后換用含0.5%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液同步化24h。按實驗分組用含不同干擾因素及10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。分別在給予干擾因素后6、12、24h后用MTT法檢測，于490nm波長處測定各孔A值。實驗重復(fù)3次，每次6個復(fù)孔。

1.6 Western blotting檢測PCNA蛋白的表達[11]提取細胞總蛋白，以SDS-PAGE凝膠行蛋白電泳，上樣量為50μg。電泳完畢將蛋白轉(zhuǎn)到聚偏氟乙烯膜(PVDF)上。轉(zhuǎn)膜后在含5%脫脂奶的TBST中封閉1h，TBST洗滌3次，與1:250稀釋的PCNA及β-actin抗體反應(yīng)，4℃過夜。洗膜3次，加1:2000稀釋的二抗，室溫孵育1h，ECL化學(xué)發(fā)光法顯色，X線膠片曝光、顯影、定影，采用Quantity One軟件行灰度分析，以兔抗鼠β-actin作為內(nèi)參照。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理 采SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行分析。計量資料結(jié)果以±s表示，組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用Tukey多重比較法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 VSMCs的體外培養(yǎng)及鑒定 倒置相差顯微鏡下觀察，細胞為梭形或長梭形，排列成放射狀、旋渦狀，呈典型“谷”與“峰”生長現(xiàn)象(圖1A)。SM-actin單克隆抗體免疫組化染色可見胞質(zhì)肌絲呈典型棕黃色細顆粒狀沉淀，陽性率達95%以上，表明VSMCs純度高(圖1B)。

圖1 體外培養(yǎng)的VSMCs形態(tài)及鑒定Fig. 1 Morphology and identification of VSMCs cultured in vitro

2.2 白藜蘆醇對AngⅡ誘導(dǎo)VSMCs增殖的影響在6、12、24h時間點，AngⅡ組細胞數(shù)均明顯高于對照組(P＜0.05)，而10、30、100μmol/L白藜蘆醇組細胞數(shù)在各時間點與對照組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。AngⅡ+30μmol/L白藜蘆醇組和AngⅡ+100μmol/L白藜蘆醇組各時間點細胞數(shù)均低于AngⅡ組(P＜0.05)，而AngⅡ+10μmol/L白藜蘆醇組細胞數(shù)在各時間點與AngⅡ組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05，表1)，表明30μmol/L和100μmol/L白藜蘆醇均可阻斷AngⅡ誘導(dǎo)的VSMCs增殖，而10μmol/L白藜蘆醇無此作用。

2.3 白藜蘆醇對AngⅡ調(diào)節(jié)VSMCs細胞活力的影響 MTT法檢測顯示，AngⅡ組A值在6、12、24h均明顯高于對照組(P＜0.05)，而10、30、100μmol/L白藜蘆醇組A值在各時間點與對照組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。與AngⅡ組比較，AngⅡ+30μmol/L白藜蘆醇組和AngⅡ+100μmol/L白藜蘆醇組各時間點A值均明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，而AngⅡ+10μmol/L白藜蘆醇組A值在各時間點與AngⅡ組比較無明顯差異(P＞0.05，表2)，表明30、100μmol/L白藜蘆醇均可阻斷AngⅡ增強VSMCs細胞活力的作用，而10μmol/L白藜蘆醇則無此作用。

表1 各組血管平滑肌細胞計數(shù)結(jié)果(×105/ml，±s，n=3)Tab. 1 VSMCs count in different groups (×105/ml,±s, n=3)

表1 各組血管平滑肌細胞計數(shù)結(jié)果(×105/ml，±s，n=3)Tab. 1 VSMCs count in different groups (×105/ml,±s, n=3)

(1)P＜0.05 compared with control group; (2)P＜0.05 compared with AngⅡgroup

2.4 復(fù)合物C對白藜蘆醇抑制AngⅡ誘導(dǎo)VSMCs細胞增殖及PCNA蛋白表達的影響 采用1μmol/L復(fù)合物C預(yù)處理后，與AngⅡ+白藜蘆醇組比較，復(fù)合物C+AngⅡ+白藜蘆醇組VSMCs細胞數(shù)增加38.0%，細胞活力增加22.1%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。Western blotting檢測顯示：與對照組比較，AngⅡ組VSMCs內(nèi)PCNA蛋白表達顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。與AngⅡ組比較，白藜蘆醇+AngⅡ組PCNA蛋白表達顯著降低(P＜0.05)。采用復(fù)合物C預(yù)處理后，復(fù)合物C+AngⅡ+白藜蘆醇組VSMCs細胞內(nèi)PCNA蛋白表達顯著高于白藜蘆醇+AngⅡ組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05，圖2)。

表2 MTT法檢測細胞活力(A值，n=3)Tab. 2 Activity of VSMCs measured by MTT assay (A value, n=3)

圖2 不同處理對VSMCs內(nèi)PCNA蛋白表達的影響Fig. 2 Effects of resveratrol and AngⅡ on the protein expression of PCNA in VSMCs

3 討 論

動脈粥樣硬化是由多種病因造成的始發(fā)于動脈壁內(nèi)膜的一系列復(fù)雜的分子和細胞改變的總結(jié)果，也是誘發(fā)冠心病、心肌梗死、腦梗死等心腦血管疾病的主要原因[12]。流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，有飲用適量葡萄酒習(xí)慣的人其心血管疾病的發(fā)病率和病死率相對較低，進一步研究發(fā)現(xiàn)這一現(xiàn)象可能與葡萄酒中含有較高含量的白藜蘆醇有關(guān)[13]。現(xiàn)代藥理學(xué)研究證實，白藜蘆醇具有多種藥理學(xué)作用，如抗炎、抑制血小板聚集、調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝、保護心血管缺血性損傷和抗腫瘤等[14]。

VSMCs異常增殖是高血壓、冠狀動脈粥樣硬化和冠狀動脈介入治療術(shù)后再狹窄等疾病的主要病理生理機制[15]。AngⅡ是一種重要的血管活性物質(zhì)，在體內(nèi)和體外均可誘導(dǎo)VSMCs過度增殖，而抑制此作用可阻止多種心血管疾病的發(fā)生及發(fā)展[16]。本研究發(fā)現(xiàn)AngⅡ能夠顯著增加VSMCs細胞的增殖能力、細胞活性及增殖標志物PCNA蛋白的表達，且30、100μmol/L白藜蘆醇能夠抑制AngⅡ誘導(dǎo)的VSMCs增殖，而10μmol/L白藜蘆醇則無此作用，提示白藜蘆醇對VSMCs增殖的影響呈濃度依耐性。Schreiner等[17]研究發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇可抑制AngⅡ誘導(dǎo)的VSMCs信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子激活，進而發(fā)揮相應(yīng)的生物學(xué)作用，且這一作用與白藜蘆醇抗氧化作用有關(guān)，但其具體機制尚未闡明。

本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，100μmol/L白藜蘆醇可顯著減輕高糖對血管舒張活動的抑制作用，進一步研究發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇能夠激活A(yù)MPK，進而誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞內(nèi)一氧化氮等生物活性物質(zhì)釋放，起到抗氧化和抗炎癥反應(yīng)的作用[5]。AMPK是廣泛存在于真核生物細胞中的一種信號通路分子，介導(dǎo)多種細胞生物學(xué)功能，本研究結(jié)果顯示，給予復(fù)合物C抑制細胞內(nèi)AMPK活性后，白藜蘆醇抑制細胞增殖、活力和PCNA蛋白表達的作用被逆轉(zhuǎn)。該結(jié)果提示AMPK是白藜蘆醇發(fā)揮細胞保護作用的重要信號分子，激活A(yù)MPK后抑制氧化應(yīng)激可能是白藜蘆醇抑制平滑肌細胞增殖的重要作用途徑。

綜上所述，白藜蘆醇能夠抑制血管平滑肌細胞的異常增殖，進而起到預(yù)防高血壓、冠心病等心腦血管疾病的作用，而AMPK信號激活在白藜蘆醇細胞保護過程中起到重要作用。

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Inhibitory effect of resveratrol on proliferation of vascular smooth muscle cells induced by angiotensin Ⅱ and its underlying mechanism

GAO Pan, SI Liang-yi*, XU Qiang, WANG Xiao-mei
Department of Geriatrics, Southwest Hospital, Third Military Medical University, Chongqing 400038, China
*

, E-mail: doctorsly@126.com
This work was supported by the National Natural Science Foundation of China (81000132), and the Special Fund of Chongqing Key Laboratory (CSTC) from Institute of Cardiovascular Science in Xinqiao Hospital (CQZDSYS201202)

ObjectiveTo explore the effect of resveratrol on proliferation of vascular smooth muscle cells (VSMCs) as induced by angiotensin Ⅱ (Ang Ⅱ) and its underlying mechanism.MethodsVSMCs of rat′s thoracic aorta were primarily cultured in vitro. For detecting the effects of resveratrol on Ang Ⅱ-induced VSMC proliferation, the cultured cells were divided into a control group, Ang Ⅱ group (1μmol/L), gradient concentrations of resveratrol groups, and Ang Ⅱ + gradient concentration of resveratrol groups. The gradient concentrations of resveratrol were set as 10, 30 and 100μmol/L. Cells in each group were treated for 0, 6, 12 and 24h, respectively. VSMC proliferation was detected by cell count assay, and the viability of the VMSC was measured by MTT assay. For detecting the effects of compound C [adenine monophosphate-activated protein kinase (AMPK) inhibitor] on biological effects of VSMCs, the cultured cells were divided into a control group, Ang Ⅱ group, resveratrol + Ang Ⅱ group and compound C + resveratrol + Ang Ⅱ group. The protein expression of proliferated cell nuclear antigen (PCNA) in each group was detected by Western blotting after being treated for 24 hours.ResultsCompared with control group, the cell viability and cell number in Ang Ⅱ group were significantly increased (P＜0.05) after Ang Ⅱ stimulation for 6, 12 and 24 hours. Compared with AngⅡ group, the cell vitality and cell number were significantly decreased in different concentrations of resveratrol + Ang Ⅱ groups (P＜0.05). On the other hand, compared with the control group, the expression of PCNA protein in Ang Ⅱ group was significantly increased (P＜0.05); as compared with Ang Ⅱ group, the expression of PCNA protein in resveratrol + Ang Ⅱ group was significantlydecreased (P＜0.05); as compared with resveratrol + Ang Ⅱ, the cell number, cell viability, and PCNA protein expression in compound C + resveratrol + Ang Ⅱ group was significantly increased (P＜0.05).ConclusionResveratrol can inhibit Ang Ⅱstimulated cell proliferation through activation of AMPK.

resveratrol; myocytes, smooth muscle; angiotensin Ⅱ; adenosine monophosphate-activated protein kinase

R541.4

A

0577-7402(2013)04-0269-05

2012-10-03；

2013-01-09)

(責任編輯：張小利)

國家自然科學(xué)基金(81000132)；重慶市新橋醫(yī)院全軍心血管研究所重點實驗室專項經(jīng)費資助項目(CQZDSYS201202)

郜攀，醫(yī)學(xué)博士，主治醫(yī)師。主要從事冠心病及其發(fā)病機制研究

400038 重慶 第三軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院老年病科(郜攀、司良毅、徐強、王笑梅)

司良毅，E-mail：doctorsly@126.com