高分子量裂褶菌多糖發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化組合

張雖栓，王 霞

（河南質量工程職業(yè)學院食品與化工系，河南平頂山467000）

高分子量裂褶菌多糖發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化組合

張雖栓，王 霞

（河南質量工程職業(yè)學院食品與化工系，河南平頂山467000）

目的:優(yōu)選高分子量裂褶菌多糖的培養(yǎng)基的最佳組合.方法:對提高高分子量裂褶菌多糖的質量分數(shù)的培養(yǎng)基組合進行了單因素和正交試驗研究，以確定最佳實驗條件.結果:KH2P04濃度為0.3%、3-吲哚丁酸的濃度為0.04%；發(fā)酵培養(yǎng)條件的選擇是：接種量為13%(V/V).結論:高分子量裂褶菌在優(yōu)化的培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)條件下得到高分子量裂褶菌多糖的質量分數(shù)達1.768%.

裂褶多糖；分離純化；培養(yǎng)；正交試驗

裂褶菌(SchizophyllumcommuneFr.簡稱SPG)是一種珍貴的藥食兼用真菌，裂褶菌胞外多糖是菌體經(jīng)深層發(fā)酵產(chǎn)生的中性胞外多糖，由單一的β-(1-3)-D-葡聚糖組成的螺旋結構和良好的水溶性，在調節(jié)免疫功能、抗腫瘤、抗輻射等方面有顯著的療效[1]，經(jīng)硫酸酸化后具有抗HIV活性，能抑制HIV-1產(chǎn)生的細胞裂變[2].其分子量從十幾萬到上百萬不等.然而，SPG的結構和分子量不同嚴重影響其生物學活性及應用.文獻報道，裂褶胞外多糖的相對分子質量多在80-100kDa[3-6]之間，而分子量在100kDa以上的裂褶菌多糖具有較強的抗腫瘤活性，在醫(yī)藥領域的應用最為廣泛，需求量最大[7].我們在微生物發(fā)酵技術研究的基礎上，利用正交試驗的方法優(yōu)化培養(yǎng)基的組合，改進培養(yǎng)工藝，提高裂褶菌多糖的質量分數(shù)，為裂褶菌菌的產(chǎn)業(yè)化栽培和進一步的開發(fā)應用提供支持.

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

裂褶菌種：昆明科技開發(fā)有限公司提供.

1.2 設備與儀器

恒溫搖床：中國科學院武漢科學儀器廠；

HZQ-F280全溫度振蕩培養(yǎng)箱：太倉市華美生化儀器廠；

真空干燥箱2K-82A型：上海市實驗儀器總廠；

pH計320-S型：METTLERTOLED；

UV-2102PC紫外——可見分光光度計：德國Bruker公司；

1.3 實驗方法

1.3.1 培養(yǎng)條件

裂褶菌種采用PDA固體培養(yǎng)基，培養(yǎng)基是由馬鈴薯180g/L,KH2PO42.8g/L,葡萄糖18g/L，Mg-SO4.7H2O1.4g/L,蛋白胨4.9g/L,pH=5.8，瓊脂20 g/L組成.配好的PDA培養(yǎng)基裝在試管中，于140℃時滅菌20Min，冷卻，將菌種接種到試管斜面培養(yǎng)基上，靜置、活化4d，活化后的菌種接入裝有50ml培養(yǎng)基的錐形瓶中，28℃下培養(yǎng)1.5d，得液體菌種；接著接種到固體培養(yǎng)基27℃下，培養(yǎng),7d，菌絲長滿后備用[8,9].

1.3.2 裂褶菌多糖百分含量測定方法

裂褶菌多糖百分含量的測定方法：采用常用的苯酚-硫酸比色法測定[10].

2 結果與討論

2.1 培養(yǎng)基的優(yōu)化

不同培養(yǎng)基的選擇對高分子量裂褶菌多糖質量分數(shù)有直接的影響，設定了碳源、氮源、KH2PO4、3-吲哚乙酸（IBA）四個因素對高分子量裂褶菌多糖培養(yǎng)基的選擇進行了試驗.

2.1.1 最佳碳源作為培養(yǎng)基對高分子量裂褶菌多糖質量分數(shù)的影響

實驗選取了1.葡萄糖（10%）、2.蔗糖（10%）、3.麥芽糖（10%）、4.葡萄糖（10%）+羧甲基纖維素（1%）、5.玉米淀粉、6.果糖（10%）作為待選碳源[11-12].發(fā)酵完成后，測定多糖含量；結果如圖1表明，葡萄糖（10%）+羧甲基纖維素（1%）是該菌種發(fā)酵生產(chǎn)的最佳碳源，多糖產(chǎn)量可達1.8%.

圖1 不同碳源對裂褶菌多糖質量分數(shù)的影響

圖2 葡萄糖含量對裂褶菌多糖質量分數(shù)的影響

最佳碳源濃度的大小對菌體的生長速度、代謝、產(chǎn)物的合成以及氧氣的流通量多少都會造成影響.若碳源用量過少，菌體生長和產(chǎn)物合成都會停止，反之，則會出現(xiàn)抑制生長的現(xiàn)象.如圖2所示，在葡萄糖濃度偏低或偏高時都會對菌體生長及多糖的合成形成抑制，使合成速率減慢，導致質量分數(shù)降低.因此，碳源濃度的大小對微生物發(fā)酵生長具有相當重要的作用.經(jīng)單因素分析，該實驗選用12%的葡萄糖做為最佳碳源.

圖2 葡萄糖含量對裂褶菌多糖質量分數(shù)的影響

2.1.3 KH2PO4的濃度對高分子量裂褶菌多糖多糖含量的影響

從圖3可知，KH2P04的濃度對裂褶菌多糖產(chǎn)量的影響表現(xiàn)出最適濃度效應.隨著KH2P04濃度的增加，裂褶菌多糖的質量分數(shù)也在不斷的提高，當KH2P04濃度達一定值后繼續(xù)升高時，裂褶菌多糖的質量分數(shù)則降低，因此，KH2P04最適添加量為0.3%.

圖3 KH2P04的含量對裂褶菌多糖產(chǎn)量的影響

2.1.4 3-吲哚乙酸的濃度對高分子量裂褶菌多糖多糖含量的影響

3-吲哚丁酸是一種植物細胞生長促進劑，它能夠刺激植物細胞快速生長，分別以3-吲哚丁酸添加量為0.02%、0.05%、0.1%和0.15%在培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，結果見圖4.

由圖4可知，開始，隨IBA含量的不斷提高，裂褶菌多糖的產(chǎn)量也隨之增加，但當IBA濃度過高時又降低了裂褶菌多糖的產(chǎn)量，故IBA含量對裂褶菌多糖促進作用的最佳濃度分別為0.04%.

圖4 IBA的含量對裂褶菌多糖質量分數(shù)的影響

2.1.5 發(fā)酵培養(yǎng)條件的正交試驗優(yōu)化

表1培養(yǎng)基優(yōu)化的正交試驗因素及水平表

表1 正交設計試驗結果

由表1正交試驗數(shù)據(jù)可以看出,實驗得到裂褶菌多糖的質量分數(shù)最高達到1.768%,最佳水平組合是A3B2C3D2,根據(jù)表中極差R的分析，各個因素對裂褶菌多糖質量分數(shù)的影響順序是A>D>C>B,因此，最佳組合為A3B2C3D2.即加人葡萄糖的含量達12%，酵母粉含量達0.8%，KH2P04的含量達0.3%，3-吲哚丁酸的含量為0.04%.

3 裂褶菌多糖的純化與分子量的測定

3.1 裂褶菌多糖的純化

經(jīng)過發(fā)酵培養(yǎng)的菌絲體→粉碎→熱水浸泡→乙醇多次沉淀→洗滌→熱水溶解→過濾，濃縮→粗多糖→活性炭褪色→Sevag法脫蛋白→裂褶菌多搪純品.

3.2 裂褶菌多糖分子量的測定

裂褶多糖分子量的測定：采用高效凝膠色譜法，利用標準多糖溶液繪制標準洗脫曲線，再根據(jù)裂褶菌多糖的洗脫曲線與標準洗脫曲線做比較，查表可知，所得多糖的分子量約為510kDa.

4 結論

(1)經(jīng)單因素實驗確定了裂褶菌生長最適宜的培養(yǎng)基成分為:以0.8%酵母粉和0.2%NH4NO3為混合氮源，3-吲哚丁酸的濃度為0.04%，KH2P04濃度為0.3%，以12%的葡萄糖為最佳碳源時，裂褶多糖的提取率最高.

(2)用高效凝膠色譜分析確定樣品單糖組分為具有良好水溶性的β-(1-3)-D葡聚糖，分子量約為510kDa.研究可知：裂褶菌多糖在調節(jié)免疫功能、抗腫瘤和抗輻射活性均與多糖的結構和相對分子質量的大小有關，較大分子量的裂褶多糖才具有更加顯著地抗腫瘤和輻射活性，本實驗為后期研究高分子量裂褶多糖的培養(yǎng)和在藥用領域的開發(fā)奠定了理論基礎.

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S646

A

1673-260X（2013）12-0060-03