紅緣擬層孔菌多糖分離純化、結構表征及其免疫活性分析

彭慧群， 徐小剛， 陳昭月， 王 力， 戴 軍*

（1.食品與技術國家重點實驗室，江南大學，江蘇 無錫 214122；2.東臺市濟民生物科技有限公司，江蘇 東臺224221；3.大連王力野生靈芝生物科技有限公司，遼寧 大連116003）

紅緣擬層孔菌（Fomitopsis pinicola）是一種藥用蘑菇，有待開發(fā)利用為食品新資源[1]。紅緣擬層孔菌能祛風、除濕，民間用于治療礦工“寒腿”病；其子實體的水提物具有抑制腫瘤等功效[2]。孫雪[3]等從紅緣擬層孔菌發(fā)酵產(chǎn)物中提取分離得到了一種單體化合物，并對其進行了抗腫瘤和免疫增強實驗的研究，在此基礎上研制出了一種抑制腫瘤的保健食品?，F(xiàn)代藥理學研究證明，該菌水提取物具有抗菌、抗腫瘤、調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)、降血糖、調(diào)節(jié)人體免疫功能以及抗氧化和清除自由基等作用[4-6]。另外，紅緣擬層孔菌具有補益作用、抗炎作用[7]、抑制水腫[8]以及治療肥胖作用[9]，可以運用到新型保健食品中。

目前，文獻已報道的關于紅緣擬層孔菌多糖的研究主要集中于紅緣擬層孔菌子實體提取物的生物活性。而關于從紅緣擬層孔菌多糖中分離出多種多糖級分，對其進行免疫活性分析并進行結構表征的報道較少。作者分別以純水和堿液從中提取得到兩類多糖，對純水提取的多糖進行分離純化，得到4個多糖級分，并均進行了體外免疫活性的檢測和比較，優(yōu)選出兩個級分對其進行結構表征，為后續(xù)構效關系研究和開發(fā)利用提供了依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑 紅緣擬層孔菌子實體：大連王力生物科技有限公司提供；三氟乙酸（TFA）：＞99%，化學純，國藥集團化學試劑有限公司；乙腈：色譜純，美國Tedia公司；1-苯基-3-甲基-5-吡唑琳酮（PMP）：99%，美國 Acros Organics公司；四甲基偶氮唑藍（MTT）：＞98%，美國 Biosharp；DMEM 培養(yǎng)液：美國Gibco生命技術公司；曲利本蘭（臺盼藍）：上?；瘜W試劑采購供應站；氯化銨和乙二胺四乙酸二鈉（EDTA-Na2）：天津市大茂化學試劑廠；C57雄性小鼠：體重為（20～25 g），蘇州艾爾麥科技有限公司；其他試劑均為分析純，國藥集團化學試劑有限公司。

1.1.2 主要儀器設備 高效液相色譜儀：Waters 1525型：安捷倫科技有限公司；冷凍干燥機：SCIENTZ-10N型，寧波新芝生物股份有限公司；多用途水浴恒溫振蕩器：DSHZ-300型：江蘇太倉市實驗設備廠；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：RE-52A型：上海亞榮生化儀器廠；可見光分光光度計722N型：上海精密科學儀器有限公司；循環(huán)水多用真空泵SHK-IIIS型：鄭州科泰實驗設備有限公司；定時數(shù)顯恒流泵HL-2D型：上海滬西分析儀器廠。

1.2 試驗方法

1.2.1 紅緣擬層孔菌子實體多糖的提取 分別采用水提醇沉和堿提醇沉的方法從紅緣擬層孔菌子實體中提取得到兩種多糖FPS、FPJ。

將粉碎的紅緣擬層孔菌子實體用95%的乙醇浸泡過夜，脫脂；在鼓風干燥箱中干燥后，加入料液比為1∶20的蒸餾水中，在100℃水浴中循環(huán)提取4～6 h。提取后真空抽濾，濾渣重復提取2～3次。合并提取液，55℃真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至小體積，加3倍體積乙醇沉淀過夜，4℃10 000 r/min離心15 min，收集沉淀，經(jīng)95%乙醇、無水乙醇依次洗滌，真空干燥得FPS[10]。將濾渣置于鼓風干燥箱中干燥8 h，將上述濾渣也真空干燥后加入料液比為1∶20的5%的NaOH溶液中，在60℃水浴中提取2 h，真空抽濾，往提取液中加入2 mol/L HCl中和，4 500 r/min離心15 min，取上清液，后續(xù)操作同純水提取粗多糖，真空干燥得FPJ[11]。

1.2.2 脫色脫蛋白

1）采用大孔吸附樹脂進行脫色：5 g D101加入250 mL的三角瓶中，再加入50 mL的5 mg/mL粗多糖溶液，放入恒溫搖床中，40℃、140 r/min振蕩8 h，過濾備用。

2）采用Sevag法脫蛋白質(zhì)[12]：往脫色后的多糖溶液中加入 Sevag試劑 （氯仿∶正丁醇=5∶1）（多糖∶Sevag 試劑=5∶1 或者 4∶1）混合，振蕩 30 min，靜置分層，棄去下層含有白色沉淀有機相，如此重復6次，減壓旋蒸濃縮后真空干燥備用。

1.2.3 FPS分離純化

1）DEAE Sepharose Fast Flow 柱分離分級：稱0.3 g經(jīng)過脫色脫蛋白質(zhì)的FPS溶于 5 mL、0.02 mol/L Tris[三（羥甲基）胺基甲烷]-HCl緩沖液（pH 7.8）中，通過 DEAE Sepharose Fast Flow 柱（3.5 cm×25 cm）進行分離，前100管用0.02 mol/L Tris-HCl緩沖液等強度洗脫，101～200管用 0.01～1 mol/L NaCl和0.02 mol/L Tris-HCl溶液梯度洗脫。流速：0.8 mL/min。以苯酚硫酸法跟蹤檢測各管中多糖質(zhì)量，繪制多糖洗脫曲線并分別收集各多糖級分，用透析袋（相對分子質(zhì)量3 500）流水透析48 h去除鹽離子等小分子物質(zhì)，真空旋蒸濃縮后冷凍干燥。

2）Sepharose CL-6B柱分離分級：稱300 mg經(jīng)DEAE Sepharose Fast Flow層析柱分離后多糖溶于10 mL 0.9%NaCl中，通過 Sepharose CL-6B（2.6 cm×95 cm）進行分離，洗脫液：0.9%NaCl，流速：0.4 mL/min。以苯酚硫酸法跟蹤檢測各管中多糖質(zhì)量，繪制多糖洗脫曲線并分別收集各多糖級分，用透析袋（相對分子質(zhì)量3 500）流水透析48 h去除鹽離子等小分子物質(zhì)，真空旋蒸濃縮后冷凍干燥。

1.2.4 4個多糖級分體外促進正常小鼠脾淋巴細胞增殖實驗 參照文獻[13]進行。

1.2.5 高效體積排阻色譜（HPSEC）分析 將不同相對分子質(zhì)量的葡聚糖標準品及各級分多糖樣品配制成約為5 mg/mL的溶液，參考文獻[14]中的色譜條件，進樣分析。

1.2.6 紅緣擬層孔菌各級分多糖的單糖組成分析

1）多糖樣品完全酸水解：將級分多糖樣品配成5 mg/mL水溶液，參考文獻[14]中的實驗方法，對級分多糖樣品進行酸水解。

2）標樣及級分多糖樣品的PMP衍生化：取100 μL混合單糖標準水溶液 （各單糖質(zhì)量濃度為3 mg/mL）和多糖樣品酸水解產(chǎn)物，參考文獻[14]中的實驗方法，對混合單糖標樣及級分多糖樣品酸水解產(chǎn)物進行PMP衍生化，進樣分析。

1.2.7 紅外光譜分析 取各級分多糖約1 mg放入研缽中，加入大約以1∶100的比例的溴化鉀充分研磨后壓片，4 000～400 cm-1區(qū)間掃描，掃描32次，分辨率為4 cm-1。

1.2.8 核磁共振分析 稱取30 mg樣品溶于0.5 mL D2O中，樣品質(zhì)量濃度為60 mg/mL，內(nèi)標物為DDS，通過核磁共振儀進行13C和1H分析[15]。

2 結果與討論

2.1 紅緣擬層孔菌粗多糖的提取率及多糖質(zhì)量

初步實驗表明，經(jīng)水提醇沉法所得的粗多糖FPS為棕褐色固體，而經(jīng)堿提中和醇沉所得的粗多糖FPJ為黑色固體，兩者均顏色較深，不易溶于水，需加熱攪拌才能溶解，且含有少量不溶物質(zhì)。不同批次紅緣擬層孔菌粗多糖的提取得率及其多糖質(zhì)量見表1。由表1數(shù)據(jù)可知，F(xiàn)PJ的得率明顯高于FPS，但是FPS的糖質(zhì)量分數(shù)高于FPJ，F(xiàn)PJ中所含雜質(zhì)較多。

表1 不同批次的FPS和FPJ的提取得率及多糖質(zhì)量Table 1 Yield and polysaccharide content of FPS and FPJ

2.2 FPS和FPJ脫色脫蛋白質(zhì)得率及多糖質(zhì)量

經(jīng)大孔吸附樹脂脫色和Sevag法脫蛋白質(zhì)后，F(xiàn)PS呈淡灰色，F(xiàn)PJ為深灰色。由于FPJ顏色較深，故對其進行兩次脫色。不同批次的FPS和FPJ脫色脫蛋白后得率及多糖質(zhì)量見表2。由表2可知，經(jīng)脫色脫蛋白處理，F(xiàn)PJ的損失率遠遠大于FPS，經(jīng)處理后FPS的純度高于FPJ，F(xiàn)PJ還是含有一定量的色素，其脫色后仍為深灰色。

表2 不同批次的FPS和FPJ脫色脫蛋白得率及多糖質(zhì)量Table 2 Recovery of decolorizing and deproteinzing of different batches FPS and FPJ and their polysaccharide content

2.3 FPS分離分級

2.3.1 DEAE-Sepharose Fast Flow柱分離分級 通過DEAE-Sepharose Fast Flow柱的洗脫液以管數(shù)為橫坐標，吸光值為縱坐標繪制洗脫曲線，見圖1。由洗脫曲線圖可知，在1.2.3的分離條件下，F(xiàn)PS的兩級分能夠很好的分離，按照出峰順序先后收集得到兩個多糖級分分別命名為FPS1、FPS2，兩級分透析除鹽后凍干供后續(xù)實驗。

圖1 FPS經(jīng)DEAE Sepharose Fast Flow柱分離的洗脫曲線Fig.1 Elution profile of FPS on DEAE Sepharose Fast Flow column

2.3.2 FPS1、FPS2經(jīng)Sepharose CL-6B柱分離分級FPS1、FPS2分別通過Sepharose CL-6B柱分離，共得到 4 個級分， 即 FPS1-1、FPS1-2、FPS2-1、FPS2-2，洗脫曲線見圖2-3。

圖2 FPS1經(jīng)Sepharose CL-6B柱分離的洗脫曲線Fig.2 Elution profile of FPS1 on Sepharose CL-6B column

2.4 各多糖級分體外對正常小鼠脾淋巴細胞增殖作用的影響

為進一步考察比較多糖級分FPS1-1、FPS1-2、FPS2-1、FPS2-2 的活性，將 FPS1-1、FPS1-2、FPS2-1、FPS2-2同時進行體外單獨促進正常小鼠脾淋巴細胞增殖試驗。結果表明：4個級分在質(zhì)量濃度為20、80、320 μg/mL時均有促脾淋巴細胞增殖活性，且FPS1-2及FPS2-1具有一定量效關系，4個多糖級分中FP2-1的促脾淋巴細胞增殖活性最強，結果見圖4。

圖3 FPS2經(jīng)Sepharose CL-6B柱分離的洗脫曲線Fig.3 Elution profile of FPS2 on Sepharose CL-6B column

圖 4 FPS1-1、FPS1-2、FPS2-1和 FPS2-2體外對正常小鼠脾淋巴細胞增殖作用的影響Fig.4 Effect of FPS1-1,FPS1-2,FPS2-1 and FPS2-2 on the proliferation of splenocytes of normaL mice in vitro

2.5 多糖級分的純度測定及相對分子質(zhì)量分布

多糖的生物活性和其相對分子質(zhì)量大小密切相關。高效體積排阻色譜法（HPSEC）是目前應用較廣泛且重復性較好、操作較簡便快速的主要分析方法之一[16]。在 1.2.5所述分析條件下，HPSEC測得FPS1-2和FPS2-1的相對分子質(zhì)量分布色譜圖見圖5。由圖5可知，兩級分均為單一對稱峰，說明FPS1-2和FPS2-1皆為均一多糖組分。重均相對分子質(zhì)量分別為 9.10×103和 3.02×105。

圖5 FPS1-2和FPS2-1的HPSEC分析圖譜Fig.5 HPSEC profile of FPS1-2 and FPS2-1

2.6 多糖級分的單糖組成

12種單糖標樣的PMP衍生化RP-HPLC圖譜見圖6。由圖6可知，在該色譜條件下12個單糖峰的分離效果較好。FPS1-2和FPS2-1完全水解后的PMP衍生化RP-HPLC圖譜見圖7。對照單糖標準品的保留時間可知，F(xiàn)PS1-2含有5種單糖，分別為甘 露 糖 （Man）、葡 萄 糖 （Glc）、半 乳糖 （Gal）、木 糖（Xyl）、 巖藻糖 （Fuc）； 其摩爾百分比 （mol%）為14.88∶12.50∶60.80∶3.18∶8.65；FPS2-1 含有 4 種單糖，分別為甘露糖（Man）、葡萄糖（Glc）、半乳糖（Gal）、巖藻糖（Fuc），其摩爾百分比（mol%）為 14.48∶37.71∶36.91∶10.90。

2.7 多糖級分紅外光譜分析

使用傅立葉變換紅外光譜儀檢測了FPS1-2和FPS2-1在4 000～400 cm-1之間的紅外光譜，結果見圖8。兩個級分的紅外光譜帶都具有多糖特征峰，（3 400±15）cm-1處的吸收峰寬且強，是由于多糖的的O-H的伸縮振動；（2 920±15）cm-1附近的中等強度的峰是由于飽和C-H的伸縮振動；（1 640±10）cm-1為酰胺羰基的特征吸收峰；1 411 cm-1處出現(xiàn)的弱峰是由于C-H的變角振動；這些特征峰均為典型的多糖特征峰。FPS1-2的紅外光譜圖在917 cm-1附近的吸收峰，是D-葡萄吡喃糖β端基差向異構的C-H變角振動，說明FPS1-2的的異頭碳構型可能有β型。FPS2-1在840～853 cm-1附近處有一吸收峰，是D-吡喃環(huán)α端基差向異構的C-H振動。930 cm-1和761 cm-1附近吸收峰是 D-葡萄吡喃糖的C-O-C骨架非對稱和對稱伸縮振動，說明FPS2-1的異頭碳構型可能有α型[17-20]。

圖612 種單糖PMP衍生物的HPLC圖譜Fig.6 Chromatograms of PMP derivatives of twelve

圖7 FPS1-2和FPS2-1的PMP衍生物的HPLC圖譜Fig.7 Chromatograms of PMP derivatives of FPS1-2 and FPS2-1

圖8 FPS1-2、FPS2-1的紅外光譜圖Fig.8 Fourier transfrom IR spectrum of FPS1-2 and FPS2-1

2.8 多糖級分核磁共振分析

FPS1-2的1H-NMR譜和13C-NMR譜見圖9-12。在1H-NMR圖中，內(nèi)標物的信號在0.33 δ處，故圖中放大區(qū)域的主要峰信號為 δ 4.98，5.03，5.07，5.12；δ 4.98 為 β 構型異頭氫信號，δ 5.03、 5.07、5.12為α構型異頭氫信號。13C-NMR圖中異頭碳區(qū)域的主要峰信號為 δ 100.64、103.90、 104.89、105.53；δ 100.64為α構型異頭碳信號，較強；δ 103.90、104.89、105.53為β構型異頭碳信號，較弱。以上數(shù)據(jù)說明此多糖的結構重復單元可能主要由4種糖殘基組成[21-23]。δ 82～84區(qū)域中無信號，說明為吡喃糖；δ 69.30是發(fā)生氧取代的C6的信號[24]，δ 63.82處為游離C6的信號。所以FPS1-2可能有α-（1→6）糖苷鍵鏈接方式。

FPS2-1H-NMR譜和13C-NMR譜的異頭區(qū)域都只有一個信號峰，說明只有一種α構型的糖殘基組成；在1H譜圖中異頭碳的信號為δ 5.50，是α型吡喃糖的質(zhì)子信號。13C-NMR譜圖中，δ 102.43是α型異頭C1的信號；δ 79.77是發(fā)生氧取代的C4的信號[25]；δ 75.84、74.11、72.83 是 C5、C4、C3 的信號[26]；δ 63.30是游離的C6信號。所以FPS2-1可能有α-（1→4）糖苷鍵鏈接方式。

圖9 FPS1-2的13H-NMR譜圖Fig.9 13H-NMR spectrum of FPS1-2

圖10 FPS1-2的13C-NMR譜圖Fig.10 13C-NMR spectrum of FPS1-2

圖11 FPS2-1的13H-NMR譜圖Fig.11 13H-NMR spectrum of FPS2-1

圖12 FPS2-1的13C-NMR譜圖Fig.12 13C-NMR spectrum of FPS2-1

3 結 語

從紅緣擬層孔菌中提取出水提多糖 （FPS），堿提多糖（FPJ）。FPS經(jīng)進一步分離純化得到4個多糖級分，對4個多糖級分進行促進正常小鼠脾淋巴細胞的增殖試驗。結果表明，四個級分在質(zhì)量濃度為20、80、320 μg/mL時均有促脾淋巴細胞增殖活性，且 FPS1-2及FPS2-1具有一定量效關系，4個多糖級分中FP2-1的促脾淋巴細胞增殖活性最強。對FPS1-2和FPS2-1進行HPSEC分析，結果表明兩個級分均為單一對稱峰，說明FPS1-2和FPS2-1皆為均一多糖組分，其重均相對分子質(zhì)量分別為9.1×103和3.02×105。FPS1-2含有5種單糖，分別為甘露糖（Man）、葡萄糖（Glc）、半乳糖（Gal）、木糖（Xyl）和巖藻糖 （Fuc）；FPS2-1含有4種單糖，分別為甘露糖（Man）、葡萄糖（Glc）、半乳糖（Gal）和巖藻糖（Fuc）。紅外、核磁共振的分析結果表明，F(xiàn)PS1-2可能有α-（1→6） 糖苷鍵鏈接方式，F(xiàn)PS2-1 可能有 α-（1→4）糖苷鍵鏈接方式。