正交試驗(yàn)優(yōu)選制首烏水煎煮工藝

張振娟 劉代華 梁建成 張三平

廣西科技大學(xué)附屬醫(yī)院 柳州市人民醫(yī)院藥劑科，廣西 柳州 545006

制首烏為蓼科植物何首烏的干燥塊根經(jīng)炮制后所得，傳統(tǒng)中醫(yī)理論認(rèn)為何首烏甘補(bǔ)兼澀，不寒不膩不燥，善補(bǔ)肝腎，益精血，為滋補(bǔ)良藥?，F(xiàn)代藥理研究表明，何首烏具有調(diào)節(jié)血脂、延緩動(dòng)脈粥樣硬化、抗衰老、提高免疫力、益智等作用[1-2]。最新藥理研究還發(fā)現(xiàn)何首烏的代表性成分二苯乙烯苷具有抗抑郁作用[3]，二苯乙烯苷含藥血清對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖有明顯促進(jìn)作用[4]，臨床上常用于高脂血癥，在養(yǎng)生保健等領(lǐng)域也有廣泛應(yīng)用。通過查詢文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，何首烏中有效成分二苯乙烯苷的提取工藝有大孔吸附樹脂法[5]、超聲提取法[6]、超臨界 CO2萃取法[7]、乙醇回流提取法[8]，未發(fā)現(xiàn)臨床上普遍使用的水提?。此逯螅┓椒ǖ难芯浚谒崛∵^程中影響有效成分溶出的因素有煎煮器具、火力、飲片大小、加水量、浸泡、煎煮時(shí)間、煎煮次數(shù)，這些因素中可控的是煎煮器具和火力，結(jié)合文獻(xiàn)資料[9-11]及生活中實(shí)際操作的情況，本試驗(yàn)選擇飲片大小、浸泡時(shí)間、煎煮時(shí)間、煎煮次數(shù)為考察因素，以制首烏的代表成分二苯乙烯苷為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)、高效液相色譜法優(yōu)選何首烏的最佳水煎煮工藝條件，為獲得高質(zhì)量的何首烏水煎劑提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC-10A高效液相色譜儀 （日本島津），SPD-10AVP紫外檢測器（日本島津），威瑪多媒體色譜數(shù)據(jù)工作站，色譜柱Hypersil CN（10 μm，4.6 mm×150 mm），電子天平（BP211D型，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）；A2366超聲波清洗器（中船重工七院七二六所），XW-80A型離心機(jī)（上海醫(yī)大儀器有限公司），針筒式微孔濾膜過濾器（水型，規(guī)格：13 mm，孔徑：0.45 μm，天津市騰達(dá)過濾器件廠）。JZY-10型電動(dòng)煎煮機(jī)、不銹鋼煎煮鍋（天津三延精密器械有限公司）。

1.2 藥材和試劑

制何首烏飲片（批號(hào)：20121022）購自廣西柳州百草堂藥業(yè)有限公司中藥飲片廠，經(jīng)廣西科技大學(xué)附屬醫(yī)院藥劑科藥檢室鑒定為蓼科植物何首烏的干燥塊根炮制品。分揀為大塊：粒徑25 mm左右，小塊：粒徑10 mm左右，粗粉：機(jī)械粉碎，過 10 目篩。對(duì)照品：2，3，5，4′-四羥基-二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷（二苯乙烯苷）（中國藥品生物制品檢定所提供，批號(hào)：110844-201109），稀乙醇（自配：取乙醇529 mL，加水稀釋至1000 mL，即得。本液在20℃時(shí)含C2H5OH應(yīng)為 49.5%～50.5%mL/mL[6]）乙腈為色譜純，水為去離子水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 HPLC 法測定 2，3，5，4′-四羥基-二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷含量[12]

2.1.1 色譜條件 色譜柱色譜柱為Hypersil CN（10 μm，4.6 mm×150 mm）；柱溫為室溫；檢測波長為320 nm；流速為0.8 mL/min；流動(dòng)相為乙腈-水（18∶82）；進(jìn)樣量為 20 μL；在上述色譜條件下，對(duì)照品和樣品的色譜圖見圖1。

圖1 對(duì)照品及制首烏HPLC色譜圖

2.1.2 對(duì)照品溶液制備 精密稱取二苯乙烯苷對(duì)照品11.86 mg，置于50 mL棕色容量瓶中，加稀乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成237.20 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。

2.1.3 陰性對(duì)照溶液的制備 按降脂方取缺何首烏的空白樣品，按供試品溶液制備陰性對(duì)照溶液。

2.1.4 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn) 取對(duì)照品溶液按《中國藥典》2010年版，連續(xù)進(jìn)樣 5 次，RSD 為 0.46%，理論塔板數(shù)按 2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯苷-2-O-β-D-葡萄糖苷計(jì)算不低于2000。取供試品溶液測定，理論塔板數(shù)按 2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯苷-2-O-β-D-葡萄糖苷計(jì)算為2957，分離度為3.22，符合《中國藥典》2010年版要求。

2.1.5 空白試驗(yàn) 吸取對(duì)照品溶液、供試品溶液、缺何首烏的陰性對(duì)照溶液，分別注入液相色譜儀，結(jié)果空白對(duì)照液在與對(duì)照品色譜相應(yīng)位置上無吸收，說明空白對(duì)照液無干擾。2.1.6線性關(guān)系的考察 精密吸取上述對(duì)照品溶液10、6、4、2、1 mL，分別置于50 mL棕色容量瓶中，加稀乙醇至刻度，搖勻，分別制成濃度為 47.44、28.46、18.98、9.49、4.74 μg/mL的溶液。分別精密吸取20 μL進(jìn)樣，按上述色譜條件測定峰面積。以進(jìn)樣濃度（X）為橫坐標(biāo)，以峰面積值（Y）為縱坐標(biāo)，計(jì)算得回歸方程為 Y=1.85×10-5X＋0.375，r=0.999988，結(jié)果表明二苯乙烯苷進(jìn)樣量在4.74～47.44 μg/mL范圍內(nèi)，峰面積與進(jìn)樣量之間呈良好線性關(guān)系。

2.1.7 精密度試驗(yàn) 精密吸取61.44 μg/mL對(duì)照品20 μg/mL連續(xù)進(jìn)樣5次，測定峰面積，RSD為0.402%，表明儀器的精密度良好。

2.1.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取供試品溶液，間隔約2 h分別于0、1、3、6、8 h 進(jìn)樣，測定峰面積，結(jié)果 RSD 為 0.1124%（n=5），表明樣品在8 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.9 加樣回收率試驗(yàn) 精密量取已知濃度的供試品溶液1mL，共 6 份，分別精密加入 1 mL 20.48、61.44、102.40 μg/mL 濃度供試品，各2份，測定，計(jì)算，加樣回收率分別為100.79%、100.61%、100.12%、99.41%、101.53%、102.09%。

2.1.10 供試品溶液的制備及測定 稱取制首烏藥材9份，150 g/份，統(tǒng)一8倍加水量，按正交表表1的設(shè)計(jì)進(jìn)行煎煮（多次煎煮者第2次及第3次的煎煮時(shí)間和加水量為第1次的一半，合并煎液），趁熱過濾，濃縮定容至200 mL。取濾液15 mL離心后上清液再經(jīng)濾紙、針筒式微孔濾膜過濾器過濾，取濾液2 mL置于10 mL棕色容量瓶中，加稀乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。在上述色譜條件下取20 μL進(jìn)樣測定，計(jì)算。

2.2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

采用L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，選擇藥材粒度、浸泡時(shí)間、煎煮時(shí)間、煎煮次數(shù)4個(gè)因素，每個(gè)因素3個(gè)水平，因素水平見表1，試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果見表2，方差分析見表3。

表1 因素水平表

表2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

2.3 正交試驗(yàn)結(jié)果分析

由直觀分析結(jié)果可以看出，4個(gè)因素對(duì)二苯乙烯苷的溶出量影響程度不同，依次為D＞C＞A＞B，故以B為誤差項(xiàng)進(jìn)行方差分析。在表3方差分析中可以知道，A、C、D三因素影響顯著，最優(yōu)水平組合為A3B2C3D3。

2.4 驗(yàn)證試驗(yàn)

取制首烏150 g三付，按最佳水煎煮工藝分別進(jìn)行煎煮，取煎液按“2.1.4”項(xiàng)下測定二苯乙烯苷含量，分別為41.32、44.11、39.88 μg/mL。驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果與正交試驗(yàn)結(jié)果基本吻合，說明工藝穩(wěn)定可行。

表3 方差分析表

3 討論

在煎煮過程中，粗粉煎液極其渾濁，分離困難，不論是家庭煎煮，還是醫(yī)療機(jī)構(gòu)代煎都難以解決，從粒度因素的試驗(yàn)數(shù)據(jù)看，小塊和粗粉的二苯乙烯苷溶出量比較接近，故應(yīng)選擇小塊粒度為最佳。

從理論上講，浸泡可以使干癟的組織細(xì)胞膨脹，細(xì)胞間隙變大，利于溶劑的穿透浸提，但試驗(yàn)結(jié)果顯示是否浸泡對(duì)本實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響不顯著，這可能是由于制何首烏質(zhì)地堅(jiān)硬，難以浸透，且因煎煮時(shí)間較長，因此相對(duì)于其他顯著因素來說影響并不大。

二苯乙烯苷為水溶性成分，較長時(shí)間的煎煮利于其溶解滲出，從試驗(yàn)結(jié)果來看二苯乙烯苷的溶出率與煎煮時(shí)間呈正相關(guān)，與理論相符。

中藥煎煮過程中，藥材內(nèi)外溶質(zhì)與溶劑的濃度差是有效成分溶出的推動(dòng)力，更換新溶劑即多次煎煮是保持最大濃度差最便利的手段，但多次長時(shí)間煎煮也會(huì)造成高分子雜質(zhì)增多，有效成分被破壞，且會(huì)造成時(shí)間和能源的浪費(fèi)，故在二煎和三煎時(shí)選定時(shí)間為頭煎的一半。

綜上所述，最佳工藝條件為A2B2C3D3，即粒度為小塊，浸泡30 min，煎煮時(shí)間70 min，煎煮3次，第2次及第3次的煎煮時(shí)間和加水量為第1次的一半，合并煎液即可。本試驗(yàn)通過正交試驗(yàn)優(yōu)選出最佳提取工藝穩(wěn)定、可靠，為何首烏的水提取工藝提供了試驗(yàn)數(shù)據(jù)，可為獲得高質(zhì)量的何首烏水煎劑提供參考。

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