正交設(shè)計(jì)堿提小米多糖

諸愛士，沈曉強(qiáng)

（浙江科技學(xué)院 生物與化學(xué)工程學(xué)院，杭州310023）

小米是一種一年生的谷類植物，作為主要的糧食作物在非洲與亞洲的許多國家特別是干旱地區(qū)廣泛被種植［1］。小米富含鈣、膳食纖維和多酚，有益健康［2］。多糖具有獨(dú)特的生物、化學(xué)和物理性質(zhì)［3－7］，并能在生物體的生長和發(fā)育中起到重要作用［8］，所以越來越多的研究者研究從生物質(zhì)中提取多糖并加以應(yīng)用。目前多糖的提取有水提［9］、酶輔助［10］、微波輔助［11］、超聲輔助［12］、酸提［13］、堿提［14］等方法。常規(guī)采用水提法，文獻(xiàn)［15］報(bào)道了采用水提法較全面地研究了小米多糖的提取影響因素，并用均勻設(shè)計(jì)對提取條件進(jìn)行了優(yōu)化。水提法雖成本低，但其提取率也低，文獻(xiàn)［15］研究得到在最佳條件下的多糖收率為7.90mg/g。因此，筆者研究了在堿溶液中的小米多糖提取。為避免物料糊化及基于文獻(xiàn)［15］研究得到的結(jié)果，采用小米的原始顆粒（直徑約為1mm）、在150r/min攪拌下提取1次，先單因素考察了堿液濃度（NaOH水溶液濃度，mol/L，全文同）、提取溫度、液固比（去離子水體積與小米質(zhì)量比，mL/g，全文同）和提取時(shí)間4個(gè)因素的影響，而后用4因素3水平的正交設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)對條件進(jìn)行了優(yōu)化。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

小米：購于杭州華商超市，內(nèi)蒙古赤峰產(chǎn)；在60℃的干燥箱中干燥4h，包裝儲藏；取樣使用前再次在60℃下恒重。

葡萄糖（分析純，天津市巴斯夫化工有限公司），苯酚（分析純，杭州雙林化工試劑廠），硫酸（分析純，浙江中星化工試劑有限公司），氫氧化鈉（分析純，杭州蕭山化學(xué)試劑廠）。

DHG－9123A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海精密實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司），BS124S型電子天平（北京塞多利斯儀器系統(tǒng)有限公司），DK－S24電熱恒溫水浴鍋（上海精宏試驗(yàn)設(shè)備有限公司），S212－40型恒速攪拌器（上海申勝生物技術(shù)有限公司），800B離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠），SHZ－ⅢB型循環(huán)水真空泵（浙江臨海市精工真空設(shè)備廠），722E型可見分光光度計(jì)（上海光譜儀器有限公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 多糖質(zhì)量濃度的測定

采用硫酸－苯酚法測定多糖質(zhì)量濃度［15］。多糖的收率計(jì)算公式見式（1）：

式（1）中：η—小米多糖的收率，mg/g；X—測試液中多糖質(zhì)量濃度，g/L，按式（2）計(jì)算［9，15］；V—粗多糖溶解定容后的溶液總體積，L；M—顆粒小米取樣質(zhì)量，g。

式（2）中：Y—485nm處的吸光度。試驗(yàn)中未發(fā)現(xiàn)堿液對多糖吸光度測定的影響。

1.2.2 試驗(yàn)方法與單因素研究

取5g于60℃下恒重過的小米放入三口燒瓶，按比例加入一定體積某個(gè)濃度的NaOH水溶液，迅速將燒瓶固定在設(shè)定為某個(gè)溫度的恒溫水浴槽中，安裝好攪拌槳和回流冷凝管，攪拌下提取一定時(shí)間；到規(guī)定時(shí)間后取出混合料液用離心機(jī)在4 000r/min下離心沉淀15min，取上清液，加3倍于所得液體體積的95%乙醇進(jìn)行醇析，再將經(jīng)醇析后的料液在4 000r/min下離心15min，然后迅速將料液抽濾，取濾餅即得小米粗多糖；將粗多糖溶解并定容，測定溶液中的多糖含量，計(jì)算小米多糖的提取收率。

研究不同堿液濃度、提取溫度、液固比和提取時(shí)間4個(gè)因素對多糖提取收率的影響。

1.2.3 正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選擇適當(dāng)?shù)乃?，進(jìn)行4因素3水平的L9（34）正交試驗(yàn)［16］，通過極差分析篩選出最佳的工藝條件組合。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素研究

2.1.1 堿濃度對收率的影響

研究了不同 NaOH 溶液濃度對多糖提取效果的影響，堿濃度分別為0.0、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2mol/L，其他條件設(shè)定如下：顆粒、150r/min攪拌、液固比20.0∶1mL/g、提取時(shí)間1.0h、提取溫度60.0℃、提取次數(shù)1次。得到的結(jié)果見圖1。

堿濃度為0.0mol/L時(shí)相當(dāng)于是水提。由圖1可見，堿提較之水提多糖收率明顯增大。隨堿濃度升高，多糖收率顯著增加，濃度到0.6mol/L后收率增加趨于平緩，到0.8mol/L時(shí)達(dá)到最大值，而后堿濃度大于0.8mol/L后多糖收率明顯下降。這是因?yàn)閴A的存在有助于解除細(xì)胞壁聚合物分子間的物理和化學(xué)作用，促進(jìn)多糖從細(xì)胞中溶出，從而提高了多糖收率，但過高的堿濃度會發(fā)生堿催化下的多糖水解，使多糖收率明顯下降，據(jù)此0.8mol/L的堿濃度較合適。

圖1 堿濃度對收率的影響Fig.1 Effects of falkali concentration on extraction yield

2.1.2 提取溫度對收率的影響

在溶液堿濃度0.8mol/L、液固比20.0∶1、150r/min攪拌下，對顆粒小米1次提取1.0h，考察了提取溫度分別為50.0、60.0、70.0、80.0和90.0℃時(shí)小米多糖的收率，結(jié)果見圖2。

從圖2可以看到，在50.0～80.0℃范圍內(nèi)，多糖收率隨溫度的升高有明顯增大，最大值出現(xiàn)在80.0℃，而后收率隨溫度進(jìn)一步增高出現(xiàn)下降。這是由于在較高的溫度下多糖的擴(kuò)散系數(shù)得到增大，在提取劑中的溶解性能即溶解度得到提高；同時(shí)降低了溶液的黏度，使傳遞阻力減小，這就加快了多糖從顆粒向溶液傳遞的速度，表現(xiàn)出多糖收率的提高；但溫度太高，多糖降解和變性的量也會隨之增大，從而會降低多糖的收率，同時(shí)能耗也增大，所以80.0℃比較適宜。

圖2 提取溫度對收率的影響Fig.2 Effects of extraction temperature on extraction yield

2.1.3 液固比對收率的影響

不同液固比對多糖收率的影響見圖3，液固比分別為10.0∶1、15.0∶1、20.0∶1、25.0∶1和30.0∶1mL/g，其他條件為：顆粒、150r/min攪拌、堿濃度0.8mol/L、提取時(shí)間1.0h、提取溫度80.0℃、提取次數(shù)1次。

液固比過小，多糖不能被有效提取，液固比過大又會增加成本。圖3顯示先隨液固比的增加多糖收率增大，這是由于液固比小時(shí)，溶液中多糖質(zhì)量濃度過高，減小了固體物料與液相溶液間的多糖質(zhì)量濃度差，從而使固相中的多糖不能全部溶出；液固比增大后，降低了液相的多糖質(zhì)量濃度，加大了兩相間多糖的質(zhì)量濃度差，促進(jìn)了固相中多糖的溶出，提高了收率。液固比到20.0∶1時(shí)收率出現(xiàn)了最大值，然而液固比超過20.0∶1后收率反而隨液固比的增大有明顯減小，這一方面是因?yàn)樵趬A濃度相同的情況下，液固比越大溶液中的堿含量就越大，多糖在堿催化下發(fā)生的水解也就越多；另一方面隨液固比增大，提取液體積增多，而醇析時(shí)加入的乙醇體積又是提取液體積的固定倍數(shù)，致使溶液中多糖質(zhì)量濃度被大大稀釋，導(dǎo)致在醇析過程中多糖不能被完全沉淀出，故收率出現(xiàn)下降，所以20.0∶1是提取多糖適宜的液固比。

2.1.4 提取時(shí)間對收率的影響

用顆粒小米，控制堿濃度0.8mol/L、液固比20.0∶1、提取溫度80.0℃，在150r/min攪拌下1次提取，分別考察提取時(shí)間0.5、1.0、1.5、2.0和2.5h時(shí)多糖的收率，結(jié)果見圖4。

圖3 液固比對收率的影響Fig.3 Effects of liquid－solid ratio on extraction yield

圖4 提取時(shí)間對收率的影響Fig.4 Effects of extraction time on extraction yield

從圖4得到，提取時(shí)間從0.5h到1.0h，多糖收率隨提取時(shí)間的延長而快速增高，到1.0h出現(xiàn)最大值，隨后收率出現(xiàn)緩慢降低。這說明提取時(shí)間也是影響多糖提取收率的一個(gè)重要因素，這是由于提取劑滲入小米顆粒、多糖從固體顆粒中釋放出溶解于提取劑并傳遞到溶液中需要一定的時(shí)間，但時(shí)間過長會使溶液中的多糖在高溫、堿性的條件下發(fā)生堿催化降解，使提取的多糖量抵不上降解的量，降低了整個(gè)收率。所以提取時(shí)間1.0h比較合適。

文獻(xiàn)［15］報(bào)道了水提時(shí)單因素考察得到的最佳時(shí)間是2.0h，均勻設(shè)計(jì)優(yōu)化是2.19h，而現(xiàn)在堿提僅需1.0h，明顯少于水提時(shí)間，這有利于生產(chǎn)效率的提高。

2.2 正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)

根據(jù)上述試驗(yàn)結(jié)果，對堿液濃度、液固比、提取時(shí)間及提取溫度4個(gè)因素進(jìn)行3水平的正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)，其他條件仍然是150r/min攪拌下對顆粒小米提取1次。表1給出了正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)的因素和水平，各條件組合下的試驗(yàn)多糖收率及極差分析見表2，趨勢圖見圖5。

表1 提取試驗(yàn)因素和水平Table 1 Levels and factors for extraction experiment

表2 正交設(shè)計(jì)結(jié)果Table 2 Results of orthogonal test

通過比較表2中各個(gè)因素極差R值的大小及圖5的形狀可以得知，在考察范圍內(nèi)，影響多糖提取因素的強(qiáng)弱順序?yàn)椋阂汗瘫龋–）＞提取溫度（B）＞堿濃度（A）＞提取時(shí)間（D）。

綜上分析可得小米多糖堿提最佳條件組合為A2B2C2D2，即堿濃度0.8mol/L、提取溫度80.0℃、液固比20∶1和提取時(shí)間1.0h，結(jié)果與單因素考察完全吻合。在此條件下重復(fù)3次試驗(yàn)，多糖收率分別為47.24、47.39、47.18mg/g，多糖平均收率為47.27mg/g，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD＝2.3‰（n＝3），說明提取工藝穩(wěn)定，且收率明顯高于水提的7.90mg/g，堿提效果好。

圖5 趨勢圖Fig.5 Tendency chart

3 結(jié) 語

研究發(fā)現(xiàn)，采用堿溶液提取小米多糖比水提多糖效率高，不僅提高了多糖收率，而且可以縮短提取時(shí)間；液固比、溫度和堿濃度相比于提取時(shí)間，對多糖收率影響的程度更大；堿提小米多糖工藝的較佳條件是：堿濃度0.8mol/L、提取溫度80.0℃、液固比20∶1和提取時(shí)間1.0h，此條件下小米多糖的收率可達(dá)47.27mg/g。

［1］Radhika G B，Satyanarayana S V，Rao D G.Mathematical model on thin layer drying of finger millet（Eluesine coracana）［J］.Advance Journal of Food Science and Technology，2011，3（2）：127－131.

［2］Subba－Rao M V S S T，Sai－Manohar R，Muralikrishna G.Functional characteristics of non－starch polysaccharides（NSP）obtained from native （n）and malted （m）finger millet（ragi，Eleusine coracana，indaf－15）［J］.Food Chemistry，2004，88（3）：453－460.

［3］Li S P，Zhao K J，Ji Z N，et al.A polysaccharide isolated from Cordyceps sinensis，a traditional Chinese medicine，protects PC12cells against hydrogen peroxide－induced injury［J］.Life Science，2003，73（19）：2503－2513.

［4］Chen R Z，Li Y，Dong H，et al.Optimization of ultrasonic extraction process of polysaccharides from Ornithogalum Caudatum Ait and evaluation of its biological activities［J］.Ultrasonics Sonochemistry，2012，19（6）：1160－1168.

［5］程仕偉，陳超男，馮志彬，等.海帶巖藻多糖的水提制備及其抗氧化活性研究［J］.食品科學(xué)，2010，31（6）：101－104.

［6］梁亦龍，閻光凡，舒坤賢，等.山藥水溶性多糖的提取及抗氧化性研究［J］.食品研究與開發(fā)，2007，28（11）：1－3.

［7］Schepetkin I A，Quinn M T.Botanical polysaccharide：Macrophage immunomodulation and therapeutic potential［J］.International Immunopharmacology，2006，6（3）：317－333.

［8］Yang B，Jiang Y M，Wang R，et al.Ultra－h(huán)igh pressure treatment effects on polysaccharides and lignins of longan fruit pericarp［J］.Food Chemistry，2008，112（2）：428－431.

［9］諸愛士，成忠.山藥多糖提取工藝響應(yīng)面法優(yōu)化［J］.浙江科技學(xué)院學(xué)報(bào)，2011，23（1）：15－19.

［10］張?jiān)謴?qiáng)，魏靜娜，等.酶法提取山藥中多糖的工藝研究［J］.中國中藥雜志，2008，33（4）：374－377.

［11］Zhang X Z，Yin F P，Liu C H，et al.Effect of process parameters of microwave assisted extraction（MAE）on polysaccharides yield from pumpkin［J］.Journal of Northeast Agricultural University，2011，18（2）：79－86.

［12］Ying Z，Han X X，Li J R.Ultrasound－assisted extraction of polysaccharides from mulberry leaves［J］.Food Chemistry，2011，127（3）：1273－1279.

［13］Gan C Y，Abdul Manaf N，Latiff A A.Optimization of alcohol insoluble polysaccharides（AIPS）extraction from the Parkia speciosa pod using response surface methodology（RSM）［J］.Carbohydrate Polymers，2010，79（4）：825－831.

［14］任初杰，高麗，王承明，等.堿提花生粕水溶性多糖工藝研究［J］.農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào)，2008，24（7）：251－254.

［15］諸愛士，葉金娜，嚴(yán)飛娜.均勻設(shè)計(jì)優(yōu)化小米多糖提取工藝［J］.浙江科技學(xué)院學(xué)報(bào)，2013，25（1）：27－32.

［16］李云雁，胡傳榮.試驗(yàn)設(shè)計(jì)與數(shù)據(jù)處理［M］.2版.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2008：128－145，226.