粒細(xì)胞集落刺激因子對(duì)腦出血大鼠腦水腫及星型膠質(zhì)細(xì)胞可塑性的影響

何曉英，付 華，袁 平，譚 華，李小剛

腦出血(intracerebral haemorrhage，ICH)具有發(fā)展快、恢復(fù)慢、致殘重的特點(diǎn)，隨著老齡化進(jìn)程加快發(fā)病率逐漸上升，嚴(yán)重威脅人類健康。實(shí)驗(yàn)證實(shí)粒細(xì)胞集落刺激因子(granulocyte colony－stimulating factor，G－CSF)作為生物大分子可穿過大鼠血－腦脊液屏障，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)揮重要的非造血功能。Laske 等［1］報(bào)道早期阿爾茨海默病 (AD)患者血漿G－CSF水平降低，外源性G －CSF 有望作為AD 新的治療策略;實(shí)驗(yàn)變態(tài)反應(yīng)性腦炎模型(EAE)證實(shí)G －CSF 在腦內(nèi)具有抗炎功能［2］;Sevimli 等［3］研究證實(shí)G－CSF 可明顯減小腦梗死動(dòng)物梗死灶、促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)。那么，G －CSF 對(duì)ICH 是否同樣具有神經(jīng)保護(hù)作用呢?本研究通過構(gòu)建ICH 模型，從腦水腫及星形膠質(zhì)細(xì)胞(Astrocyte，Ast)可塑性的角度，探討G－CSF對(duì)ICH 大鼠發(fā)揮的作用及可能機(jī)制?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物及分組 健康成年Sprague － Dawley 大鼠96 只，體質(zhì)量(250 ～320)g，SPF 級(jí)，由瀘州醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。實(shí)驗(yàn)大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組(n =24)、ICH 組和干預(yù)組(n=36)，各組又分6h、24h、48h、72h、7d、10d 6 個(gè)亞組(假手術(shù)組n=4，ICH 組、干預(yù)組n=6)。

1.1.2 主要試劑及儀器 重組人粒細(xì)胞集落刺激因子注射液(rhG－CSF，深圳新鵬生物工程有限公司);膠質(zhì)原纖維酸性蛋白(GFAP)抗體(NeuMarker 公司);人基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP－9)抗體(Santa Cruz 公司);SABC 試劑盒、DAB 顯色試劑盒以及二抗(武漢博士德公司)。大鼠腦立體定位注射儀(WDT－V，西安西北光電廠)。

1.2 方法

1.2.1 ICH 模型的制作［4］SD 大鼠術(shù)前禁食12h，2%戊巴比妥鈉(50mg/kg)腹腔注射后，俯臥位固定在立體定位儀上，無菌操作暴露前囟，用小型牙科鉆鉆透顱骨至硬腦膜處，定位于前囟前0.2 mm、中線右側(cè)旁開3mm、深6mm 為注血點(diǎn)，將非肝素抗凝斷尾獲取的動(dòng)脈血50μl，先注入10μl，停針2min，后緩慢注入40μl，整個(gè)注血時(shí)間約5min，注血完畢后留針10～15min，再緩慢退針。術(shù)后青霉素粉末涂抹局部，縫合皮膚。所用手術(shù)器械經(jīng)高壓滅菌消毒，整個(gè)手術(shù)過程無菌操作。假手術(shù)組:參照上述方法，經(jīng)注入點(diǎn)注入等量無菌0.9%氯化鈉溶液。干預(yù)組制模成功1h 后經(jīng)腹腔注射rhG －CSF (60μg/kg)，假手術(shù)組、ICH 組經(jīng)腹腔注射等量0.9%氯化鈉溶液。

1.2.2 模型制作成功判斷 SD 大鼠麻醉清醒后用Garcia 測(cè)評(píng)18 分制法［5］進(jìn)行神經(jīng)癥狀學(xué)評(píng)分，評(píng)分為3 ～12 分的大鼠為制模成功進(jìn)入實(shí)驗(yàn)，死亡及評(píng)分＞12 分大鼠剔除出實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 腦組織含水量測(cè)定 采用干濕測(cè)重法:各組大鼠于相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)(假手術(shù)組n=2，ICH 組、干預(yù)組n =3)麻醉后迅速斷頭，剝離顱骨及硬腦膜，取出完整腦組織，去除腦膜、低位腦干和小腦，在電子精密天平上稱重 (濕重)，然后在100℃烤箱內(nèi)烘烤24h，電子天平再次稱重直到最后兩次的質(zhì)量差≤0.2mg 為止(干重)。按公式:BWC = (濕重－干重)÷濕重×100%計(jì)算腦組織含水量。

1.2.4 免疫組化檢測(cè)MMP－9、GFAP 各組大鼠于相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)(假手術(shù)組n=2，ICH 組、干預(yù)組n =3)麻醉后，經(jīng)主動(dòng)脈灌注4%多聚甲醛，取出腦組織，多聚甲醛固定，石蠟包埋、切片。按照免疫組織化學(xué)試劑盒說明進(jìn)行染色。采集系統(tǒng)對(duì)MMP－9、GFAP 的表達(dá)測(cè)定采用陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)法，每只大鼠選1 張腦切片，在400 倍光鏡下隨機(jī)選取血腫周圍的4 個(gè)視野，計(jì)數(shù)每個(gè)視野的陽性細(xì)胞數(shù)，取平均值。MMP－9 陽性表達(dá)為細(xì)胞胞膜及胞漿呈棕褐色，GFAP 陽性表達(dá)為細(xì)胞胞漿及星狀突起纖維呈黃色或黃棕色。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)量資料以(± s)表示，多組間比較采用單因素方差分析(One－Way ANOVA)的最小顯著差法(LSD)，兩樣本均數(shù)比較采用t 檢驗(yàn)，腦組織含水量、MMP －9 進(jìn)行直線相關(guān)分析，以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組ICH 大鼠腦組織含水量比較 3 組各時(shí)間點(diǎn)腦組織含水量比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05);ICH 組腦組織含水量各時(shí)間點(diǎn)與假手術(shù)組及干預(yù)組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05，見表1)。

2.2 各組ICH 大鼠血腫周圍組織中MMP －9 表達(dá)比較 3 組各時(shí)間點(diǎn)MMP－9 表達(dá)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05);ICH 組各時(shí)點(diǎn)MMP－9 表達(dá)與假手術(shù)組及干預(yù)組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05，見表2 及圖1、2、3)。

表1 各組不同時(shí)間點(diǎn)腦組織含水量比較(±s，%)Table 1 Comparison of the water content of brain tissue in each group at different time points

表1 各組不同時(shí)間點(diǎn)腦組織含水量比較(±s，%)Table 1 Comparison of the water content of brain tissue in each group at different time points

注:與假手術(shù)組比較，* P ＜0.05;與ICH 組比較，△P ＜0.05

組別 只數(shù)6h 24h 48h 72h 7d 10d假手術(shù)組 24 77.80±0.48 77.54±0.62 77.28±0.53 77.55±0.26 78.02±0.57 77.73±0.34 ICH 組 36 80.10±0.18* 82.47±0.10* 84.15±0.58* 84.10±0.51* 80.39±0.39* 79.43±0.26*干預(yù)組 36 78.03±0.11△79.02±0.91△80.87±0.25△79.73±0.27△78.12±0.38△77.74±0.28△

表2 各組不同時(shí)間點(diǎn)血腫周圍MMP－9 表達(dá)比較(±s)Table 2 Comparison of expression of MMP －9 around hematoma in each group at different time points

表2 各組不同時(shí)間點(diǎn)血腫周圍MMP－9 表達(dá)比較(±s)Table 2 Comparison of expression of MMP －9 around hematoma in each group at different time points

注:與假手術(shù)組比較，* P ＜0.05;與ICH 組比較，△P ＜0.05

組別 只數(shù)6h 24h 48h 72h 7d 10d假手術(shù)組 24 1.35±0.88 1.45±0.83 1.65±0.82 1.60±0.74 1.55±0.81 1.40±0.75 ICH 組 36 6.35±0.87* 8.20±0.85* 10.35±0.60* 10.55±0.82* 3.70±0.38* 3.06±1.08*干預(yù)組 36 3.32±0.20△ 5.54±0.11△ 6.83±0.25△ 6.80±0.45△2.85±0.01△1.98±0.23△

圖1 假手術(shù)組MMP－9 少量表達(dá)(×400)Figure 1 Few expression of MMP－9 in sham operation group

圖2 ICH 組72h MMP－9 大量表達(dá)(×400)Figure 2 Abundant expression of MMP－9 in ICH group in 72h

圖3 干預(yù)組72h MMP－9 表達(dá)量較ICH 組減少(×400)Figure 3 72h MMP－9 intervention group decreased compared with that in ICH group

2.3 腦組織含水量與MMP－9 相關(guān)性分析 假手術(shù)組腦組織含水量與MMP－9 表達(dá)無線性相關(guān)(r =0.429，P =0.3961);ICH 組腦組織含水量與MMP －9 表達(dá)呈正相關(guān)(r =0.922，P=0.0089);干預(yù)組腦組織含水量與MMP－9 表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.844，P=0.0345)。

2.4 各組ICH 大鼠血腫周圍組織中GFAP 測(cè)定 假手術(shù)組未見GFAP 陽性細(xì)胞表達(dá)。ICH 組6h 即有少量GFAP 陽性細(xì)胞表達(dá)，分布稀疏、著色較淺、胞體體積較小、突起分支較少;48h 開始增多，72h 出現(xiàn)大量表達(dá)，7d GFAP 達(dá)高峰，胞體肥大、突起增粗且增長(zhǎng)、著色較深;10d GFAP 陽性細(xì)胞表達(dá)減少。干預(yù)組6h GFAP 陽性細(xì)胞表達(dá)與ICH 組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05);24h、48h、72h、7d、10d 與ICH 組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)，細(xì)胞變形程度減輕(見表3 及圖4、5、6)。

表3 各組不同時(shí)間點(diǎn)血腫周圍GFAP 陽性細(xì)胞表達(dá)比較(±s)Table 3 Comparison of expression of GFAP positive cells around hematoma in each group at different time points

表3 各組不同時(shí)間點(diǎn)血腫周圍GFAP 陽性細(xì)胞表達(dá)比較(±s)Table 3 Comparison of expression of GFAP positive cells around hematoma in each group at different time points

注:－為無GFAP 陽性蛋白表達(dá);與ICH 組比較，▲P ＜0.05

6h 24h 48h 72h 7d 10d假手術(shù)組組別 只數(shù)24－－－－－－ICH 組 36 18.58±1.42 28.27±1.30 39.24±6.70 51.57±6.97 70.61±6.85 53.47±6.02干預(yù)組 36 19.02±1.53 20.02±2.30▲32.46±4.49▲36.33±5.35▲45.25±6.17▲39.19±5.64▲

圖4 假手術(shù)組無GFAP 表達(dá)(×400)Figure 4 No expression of GFAP in sham operation group

圖5 ICH 組7d GFAP 大量表達(dá)(×400)Figure 5 Abundant expression of GFAP in ICH group in 72h

圖6 干預(yù)組7dGFAP 表達(dá)量較ICH 組減少(×400)Figure 6 72h GFAP intervention group decreased compared with that in ICH group

3 討論

G－CSF 是一種20kDa 的蛋白質(zhì)，屬造血生長(zhǎng)因子家族的一員，在臨床已廣泛用于腫瘤患者化療后或血液系統(tǒng)疾病如粒細(xì)胞減少癥等的治療。近年來越來越多的實(shí)驗(yàn)證據(jù)表明G－CSF存在中樞神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)揮著重要的非造血功能。初期學(xué)者們推測(cè)G －CSF 在中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)揮生物學(xué)作用可能是G－CSF動(dòng)員了自體骨髓干細(xì)胞(BMSC)，然后透過血－腦脊液屏障進(jìn)入顱內(nèi)，橫向分化成神經(jīng)干細(xì)胞，從而促進(jìn)神經(jīng)元再生以及神經(jīng)功能恢復(fù)［6］。隨著研究的深入，Sch?bitz 等［7］在離體實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)在受到刺激的星形膠質(zhì)細(xì)胞上有G －CSF 表達(dá)，Schneider 等［8］采用雙重免疫標(biāo)記法標(biāo)記NeuN 與G －CSF，發(fā)現(xiàn)體內(nèi)正常腦組織神經(jīng)元上也有G － CSF 表達(dá)。另一方面，Schneider 等［8］應(yīng)用免疫組化、western Blot 和RT－PCR 法均證實(shí)鼠腦的神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞有G－CSF 受體(G－CSF－R)存在。在此基礎(chǔ)上，Hasselblatt 等［9］試驗(yàn)證實(shí)G －CSF 在中樞神經(jīng)系統(tǒng)通過與效應(yīng)細(xì)胞表面特異性G －CSF －R 結(jié)合發(fā)揮生物學(xué)作用。腦組織存在內(nèi)源性G －CSF 并在特定的條件下能與G－CS－R結(jié)合參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)復(fù)雜的病理生理過程，那么，外源性G－CSF 能否透過血－腦脊液屏障進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)呢?Solaroglu 等［10］采用不能透過血－腦脊液屏障的碘化牛血清蛋白作為對(duì)照，給大鼠注射碘化的G － CSF，計(jì)算注射后1h、4h、24h 碘化G－CSF 和碘化清蛋白的腦/血清比值，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)G－CSF 顯示一個(gè)較高的腦/血清比值，證實(shí)G －CSF 能夠通過完整的血－腦脊液屏障，為外源性G －CSF 治療中樞系統(tǒng)疾病提供了科學(xué)的基礎(chǔ)理論依據(jù)。

G－CSF 對(duì)缺血性腦血管病神經(jīng)保護(hù)作用的研究較多，動(dòng)物及部分臨床實(shí)驗(yàn)均證實(shí)腦梗死后G－CSF 可以減少神經(jīng)元凋亡、促進(jìn)血管新生、減輕炎癥反應(yīng)、減少梗死面積等［11－12］。而G－CSF 對(duì)ICH 的神經(jīng)保護(hù)作用及機(jī)制的研究鮮見報(bào)道。腦水腫是ICH 最為嚴(yán)重的繼發(fā)性損傷，本實(shí)驗(yàn)建立大鼠自體血ICH 模型，研究顯示ICH 組腦組織含水量各時(shí)間點(diǎn)明顯高于假手術(shù)組，48 ～72h 達(dá)高峰，至第7d 后逐漸恢復(fù);而干預(yù)組腦組織含水量各時(shí)間點(diǎn)明顯低于ICH 組，說明G －CSF 減輕了ICH 后的腦水腫。實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究了G －CSF 減輕腦水腫程度的可能機(jī)制，MMP －9 是影響腦水腫發(fā)生發(fā)展的重要因素之一。Gursoy－Ozdemir 等［13］對(duì)基因遺傳工程小鼠的實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)MMP－9 能夠改變血－ 腦脊液屏障通透性并加重腦水腫。應(yīng)用核磁共振技術(shù)對(duì)臨床患者觀察發(fā)現(xiàn)，ICH 患者腦水腫消漲規(guī)律與血清MMP－9 變化一致［14］。本實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)ICH 組各時(shí)點(diǎn)MMP－9 表達(dá)明顯高于假手術(shù)組，48 ～72h 達(dá)高峰，對(duì)ICH組中MMP－9 表達(dá)和腦組織含水量進(jìn)行相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)兩者呈正相關(guān)，說明ICH 后MMP －9 表達(dá)增強(qiáng)并參與了ICH 后腦水腫形成。干預(yù)組各時(shí)點(diǎn)MMP －9 表達(dá)明顯輕于ICH 組，提示G－CSF 抑制了MMP－9 的表達(dá)，相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)干預(yù)組MMP－9 表達(dá)和腦組織含水量也呈正相關(guān)。因此，G －CSF 可能通過下調(diào)MMP －9 的表達(dá)減輕了ICH 后腦水腫，其確切機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

Ast 是腦內(nèi)數(shù)量最多的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞類型，正常條件下，它對(duì)神經(jīng)元起到營(yíng)養(yǎng)、支持、保護(hù)作用，并積極參與神經(jīng)元再生修復(fù)的電生理活動(dòng)。受到某些外傷、應(yīng)激、腦損傷后Ast 具有改變自身特性適應(yīng)損傷刺激的能力，即可塑性，稱之為Ast活化，其表型上包括:細(xì)胞數(shù)量上的增加，細(xì)胞胞體、胞核大小及突起長(zhǎng)度的變化［15］。GFAP 是Ast 獨(dú)有的骨架蛋白，在有活性的Ast 中豐富表達(dá)，GFAP 在正常Ast 分布較少，其主要存在于活化Ast 中，其表達(dá)與Ast 的活性呈正比，可反映Ast的活化程度［16］?；罨腁st 在腦損害后有利弊雙向作用，一方面，調(diào)節(jié)細(xì)胞鉀、鈣內(nèi)外離子的濃度可增強(qiáng)能量代謝能力;釋放神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子 (GDNF)、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)、腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)等營(yíng)養(yǎng)成分和細(xì)胞因子;合成大量的載脂蛋白E 重建神經(jīng)元完整性，修復(fù)神經(jīng)功能，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用［17］。另一方面，活化的Ast 可產(chǎn)生大量一氧化氮(NO)，通過對(duì)大分子特別是DNA 的修飾，可導(dǎo)致細(xì)胞凋亡和壞死;可以產(chǎn)生多種細(xì)胞因子和炎性遞質(zhì)介導(dǎo)炎性反應(yīng)，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞壞死，引起血－腦脊液屏障開放，參與腦水腫病理過程;過度的膠質(zhì)化也可以作為機(jī)械屏障妨礙髓鞘和軸索的再生，影響周圍神經(jīng)組織結(jié)構(gòu)和功能恢復(fù)［18］。因此，活化的Ast 對(duì)ICH 后神經(jīng)組織是一把雙刃劍，依靠神經(jīng)系統(tǒng)代償性的自我調(diào)節(jié)不足以既發(fā)揮Ast 的神經(jīng)保護(hù)作用，同時(shí)又抑制Ast 神經(jīng)毒性作用，可能是導(dǎo)致ICH 預(yù)后不佳的因素之一。因此，Ast 在ICH 中適度活化無疑具有重要意義。

Komine－Kobayashi 等［19］研究發(fā)現(xiàn)G －CSF 干預(yù)腦梗死后活化的Ast 減少，其表達(dá)的一氧化氮合酶(iNOS)被抑制，腦損害程度減輕。本實(shí)驗(yàn)也觀察到假手術(shù)組無GFAP 陽性細(xì)胞表達(dá)，表明Ast 處于相對(duì)穩(wěn)定狀態(tài);ICH 組6h 開始GFAP 少許表達(dá)，隨時(shí)間延長(zhǎng)逐漸增多，72h 大量表達(dá)，7d 達(dá)高峰，該規(guī)律與已有研究報(bào)道基本一致［20］;干預(yù)組6h GFAP 表達(dá)與ICH組相似，24h、48h、72h、7d、10d 時(shí)GFAP 表達(dá)較ICH 明顯減少，細(xì)胞變形程度減輕，實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示G －CSF 下調(diào)了ICH后GFAP 表達(dá)，抑制Ast 過度活化。理論上G － CSF 抑制了ICH 大鼠Ast 過度膠質(zhì)化，可增強(qiáng)對(duì)神經(jīng)元的保護(hù)作用，而減輕對(duì)腦組織的損傷作用，但是怎樣才能使GFAP 恰好維持在一個(gè)適當(dāng)?shù)乃綇亩畲笙薅劝l(fā)揮Ast 的神經(jīng)保護(hù)作用以及G－CSF抑制Ast 過度活化的確切機(jī)制有待深入研究。

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