復(fù)方毛冬青離子透入劑的薄層鑒定及總黃酮的含量測(cè)定

陳 凌，王法琴，楊堯新

(1.蘭州大學(xué)第二醫(yī)院;2.蘭州大學(xué)藥學(xué)院，蘭州 730030)

復(fù)方毛冬青離子透入劑是由毛冬青、紅花、當(dāng)歸、吲哚美辛等中西藥組成，經(jīng)直流電局部導(dǎo)入，具有活血化瘀、消腫活筋、消炎止痛的功能。用于治療急慢性扭挫傷、跌打腫痛、落枕、肩周炎、骨質(zhì)增生、腰肌勞損、陳舊性傷痛、風(fēng)濕及類風(fēng)濕疼痛，腰椎間盤突出引起的腰腿痛等癥。為了鑒別本制劑成分以及有效地控制制劑的內(nèi)在質(zhì)量，本研究對(duì)制劑中紅花、當(dāng)歸、毛冬青進(jìn)行了薄層色譜鑒定，對(duì)制劑中主要成分總黃酮采用紫外分光光度法進(jìn)行含量測(cè)定，旨在為該制劑的質(zhì)量控制提供有效的定量、定性方法，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 UV-2401PC紫外可見分光光度計(jì)(日本島津);吉尼斯系列電子分析天平(Model NE2155，Genius，Germany);SYG2004恒溫水浴鍋。

1.2 材料 蘆丁(批號(hào):080-9002，中國(guó)藥品生物制品檢定所);復(fù)方毛冬青離子透入劑(自制)，薄層G板(自制);純化水;其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層鑒別

2.2.1 毛冬青 供試品溶液的制備:精密量取本品30 ml于錐形瓶中，加入甲醇30 ml混勻，靜置20 min，過(guò)濾，濾液回收甲醇至干，向其中加入約2 ml水溶解，置離心管中再加入2 ml正丁醇，超聲震蕩后離心，取上層正丁醇液作供試品溶液，置冰箱中備用。取毛冬青空白對(duì)照樣品30 ml，同法制得空白對(duì)照溶液。另取毛冬青對(duì)照藥材5 g置于錐形瓶中，加入甲醇50 ml后，超聲震蕩提取40 min，過(guò)濾，濾液回收甲醇至干，向其中加入約5 ml水溶解，用正丁醇10 ml、10 ml、5 ml分 3 次萃取，合并萃取液蒸干，加入甲醇2 ml溶解后置冰箱中保存，作為對(duì)照藥材溶液。薄層色譜法試驗(yàn):以文獻(xiàn)［1-2］TLC法，分別吸取供試品溶液，空白對(duì)照溶液，對(duì)照藥材溶液各10 μl點(diǎn)于同一塊硅膠G薄層板上，以冰醋酸—乙酸乙酯—甲酸(10∶2∶0.5)為展開劑，展開，取出，晾干，在紫外燈(365 nm)下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上顯相同顏色的主斑點(diǎn)，空白對(duì)照無(wú)干擾，見圖1。

圖1 毛冬青的TLC

2.2.2 紅花 取樣品20 ml水浴蒸干，稱取0.5 g粉末加入80%丙酮1 ml溶解，搖勻后置冰箱中備用。取紅花空白對(duì)照樣品20 ml，同法制得空白對(duì)照溶液。另取紅花對(duì)照藥材2 g，用40%乙醇浸泡過(guò)夜，過(guò)濾，水浴蒸干濾液，殘?jiān)?0%丙酮1 ml溶解后，作為對(duì)照藥材溶液。以文獻(xiàn)［1］TLC法，分別吸取供試，空白對(duì)照樣品溶液，對(duì)照藥材溶液各10 μL點(diǎn)于同一塊硅膠 G薄層板上，以正丁醇-甲醇-水(6∶1∶5)為展開劑，展開，取出，晾干，用氨水薰15 min，在紫外燈(365 nm)下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，空白對(duì)照無(wú)干擾，見圖2。

圖2 紅花的TLC

2.2.3 當(dāng)歸 取水浴蒸干后的樣品0.5 g，加入20 ml乙醚超聲10 min，過(guò)濾，50°C 水浴蒸干濾液，殘?jiān)尤?5%乙醇1 ml溶解，作為供試品溶液。取當(dāng)歸空白對(duì)照樣品0.5 g，同法制得空白對(duì)照溶液。另取當(dāng)歸對(duì)照藥材0.5 g，同法制得對(duì)照藥材溶液。按文獻(xiàn)［5］試驗(yàn)，分別吸取上述溶液各10 μl點(diǎn)于同一塊硅膠G薄層板上，以苯—乙酸乙酯—甲酸(4∶1∶0.1)為展開劑 ，展開，取出，晾干，置紫外燈(365 nm)波長(zhǎng)下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，空白對(duì)照無(wú)干擾，見圖3。

圖3 當(dāng)歸的TLC

2.3 含量測(cè)定

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)貯備液的制備 精密稱取蘆丁對(duì)照品10.15 mg，置 50 ml量瓶中，加適量 30% 乙醇，置80℃水浴中加熱使溶解，放冷，加30%乙醇至刻度，搖勻，即得(每1 ml中含無(wú)水蘆丁0.203 mg)。

2.3.2 供試品溶液的制備 精密量取樣品續(xù)濾液5 ml，置25 ml容量瓶中，加30%乙醇至刻度，搖勻。精密量取稀釋液0.4 ml，置10 ml容量瓶中，加入亞硝酸鈉溶液(1.25→25)0.3 ml，搖勻，放置 6 min，再加入硝酸鋁溶液(2.5→25)0.3 ml，搖勻，放置 6 min，加入 1 mol·L‐1氫氧化鈉溶液 4 ml，加 30% 乙醇定容至刻度，搖勻，放置10 min，作為供試品溶液。

2.3.3 測(cè)定波長(zhǎng)的選擇 精密量取標(biāo)準(zhǔn)貯備液2 ml，置10 ml容量瓶中，按 2.3.2 項(xiàng)下操作，作為對(duì)照品溶液。另精密量取供試品溶液2份，其中一份如對(duì)照品溶液處理，作為供試品溶液，另一份直接用30%乙醇定容至刻度，作為陰性樣品溶液。利用紫外可見分光光度計(jì)在200～800 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描，用加等量顯色劑的30%乙醇液做空白，測(cè)得在510 nm波長(zhǎng)處有最大吸收，測(cè)定吸收度。如圖4所示:

圖4 紫外分光光譜圖

2.3.4 線性關(guān)系考察 精密吸取 0.5、1.0、2.0、3.0、5.0 ml對(duì)照品溶液，分別置 10 ml容量瓶中，按2.3.2項(xiàng)下操作。在510 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸收度，用加等量顯色劑的乙醇液做空白，以濃度(C)對(duì)吸收度(A)作線性回歸，得回歸方程為 C=94.24-0.459(r=0.9998)。結(jié)果表明:蘆丁在 10.15 ～101.5 μg·ml-1濃度范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系。

2.3.5 精密度實(shí)驗(yàn) 精密吸取對(duì)照品溶液1.0，2.0，3.0 ml于10 ml容量瓶中，按2.3.2 項(xiàng)下操作。測(cè)定吸收度，計(jì)算日內(nèi)RSD及日間RSD，日內(nèi)RSD=0.98%(n=5)，日間 RSD。

2.3.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密量取供試品溶液0.5 ml和對(duì)照溶液3 ml分別置于10 ml容量瓶中，按2.3.2項(xiàng)下操作。供試品溶液利用未加顯色劑的供試品做空白，對(duì)照品溶液利用加等量顯色劑的乙醇液做空白，在60 min內(nèi)每隔15 min在510 nm測(cè)定吸收度。結(jié)果表明:對(duì)照液吸收度在60 min內(nèi)變化不大，供試品溶液吸收度在60 min內(nèi)RSD=0.469%。

2.3.7 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 精密量取5份供試品溶液0.5 ml于10 ml容量瓶中，按2.3.2項(xiàng)下操作，以未加顯色劑的供試品溶液做空白，在510 nm處測(cè)定吸收度，RSD=0.736%(n=5)。

2.3.8 加樣回收率試驗(yàn) 精密量取已知含量的供試品溶液適量，加入蘆丁對(duì)照品溶液，按2.3.2項(xiàng)下操作，利用未加顯色劑的供試品溶液做空白，在510 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸收度，結(jié)果見表1。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.3.9 復(fù)方毛冬青離子透入劑總黃酮含量測(cè)定分別精密量取3批供試品溶液0.4 ml于10 ml容量瓶中，按前面方法加入顯色劑的方法顯色，利用未加顯色劑的供試品做空白，在510 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸收度，結(jié)果見表2。

表2 樣品總黃酮含量測(cè)定結(jié)果(n=3)

3 討論

由本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，復(fù)方毛冬青離子透入劑中毛冬青、紅花、當(dāng)歸通過(guò)薄層色譜進(jìn)行鑒別，供試品在與藥材對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上顯相同顏色熒光主斑點(diǎn)，而其空白對(duì)照組色譜不具有此斑點(diǎn)。此方法操作簡(jiǎn)單、效果明顯、易于觀察。采用紫外分光光度法測(cè)定復(fù)方毛冬青離子透入劑中總黃酮的含量，其在510 nm波長(zhǎng)處有最大吸收，通過(guò)測(cè)得標(biāo)準(zhǔn)曲線可知:黃酮在10.15 ～101.5 μg·ml‐1質(zhì)量濃度范圍內(nèi)與吸收度線性關(guān)系良好。通過(guò)加樣回收實(shí)驗(yàn)以及總黃酮含量的測(cè)定可得其結(jié)果精密度高、重現(xiàn)性良好、穩(wěn)定性好、結(jié)果準(zhǔn)確可靠。因此，通過(guò)薄層色譜以及采用紫外分光光度法對(duì)復(fù)方毛冬青離子透入劑進(jìn)行鑒別和成份含量測(cè)定方法可靠。

［1］中國(guó)藥典2005年版一部［S］.2005，附錄:31-32.

［2］何艷玲，羅 健，楊昌金.復(fù)方毛冬青注射液質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究［J］.中藥材，2001，24(7):512.

［3］何艷玲，羅 健，楊昌金.復(fù)方毛冬青注射液有效成分含量測(cè)定［J］.中藥材，2003，26(12):889.

［4］楊紅梅，歐定宏，鐘子健，等.毛冬青溶液的制備及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究［J］.中國(guó)藥房，2007，18(15):1149.

［5］周本杰，張笑云，李 梅，等.骨傷酒中沒藥及紅花的薄層色譜鑒別［J］.時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2000，11(9):803.

［6］田昌海，高晨曦，王世清.黔產(chǎn)木犀科苦丁茶及加工品中總黃酮含量測(cè)定［J］.中國(guó)醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2009，6(1):18.

［7］烏莉婭·沙衣提，耿 萍.維藥芹菜籽總黃酮含量測(cè)定及提取工藝研究［J］.湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，27:112.