營養(yǎng)和空間因素對中蜂幼蟲dynactin p62基因表達(dá)影響

曾 晶 王子龍 吳小波 顏偉玉 曾志將

（江西農(nóng)業(yè)大學(xué)蜜蜂研究所，南昌 330045）

蜂王和工蜂都是由受精卵發(fā)育而成，它們的遺傳物質(zhì)完全相同，但由于幼蟲發(fā)育過程中得到的食物和發(fā)育空間的不同，發(fā)育形成形態(tài)、壽命以及其它許多生物學(xué)特性迥然不同的蜂王和工蜂，這就是蜜蜂級型分化現(xiàn)象。

蜜蜂級型分化機(jī)理，一直是廣大生物學(xué)家所關(guān)注熱門研究領(lǐng)域。早期的研究者認(rèn)為：食物數(shù)量和成分差異是引起蜜蜂級型分化的主要原因[1]。近幾來的研究表明：DNA甲基化、組蛋白修飾、“royalactin”蛋白質(zhì)都與蜜蜂級型分化相關(guān)[2-4]。

Ku charski等受果蠅實(shí)驗(yàn)啟示，通過檢測dynactin p62甲基化水平的差異來研究西方蜜蜂（Apis mellifera）級型分化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)營養(yǎng)因素可通過影響DNA 甲基化水平調(diào)控西方蜜蜂級型分化[2]。Shi等首次發(fā)現(xiàn)空間因素也可以通過影響dynactin p62的甲基化來調(diào)控西方蜜蜂雌的級型分化[5-6]，并且發(fā)現(xiàn)：發(fā)現(xiàn)飼喂異種蜂王漿可以更顯著降低雌性蜜蜂幼蟲dynactin p62基因甲基化水平[7]。但目前關(guān)于蜜蜂DNA甲基化的研究主要集中在西方蜜蜂上，對中華蜜蜂（Apis cerana cerana，簡稱中蜂）的甲基化模式研究很少。正是鑒于此，我們在對中蜂dynactin p62基因克隆及差異表達(dá)研究此基礎(chǔ)上[8]，開展了發(fā)育營養(yǎng)和空間因素對中蜂幼蟲dynactin p62基因表達(dá)影響的研究工作，現(xiàn)總結(jié)報道如下。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 供試蜜蜂

取自江西農(nóng)業(yè)大學(xué)蜜蜂研究所飼養(yǎng)的中華蜜蜂。

1.1.2 試劑及儀器

試劑：總RNA提取試劑盒Trizol，RNA酶抑制劑購自全式金公司；DNA marker DL2000，M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶及SYBR GreenⅡ熒光定量試劑購自TaKaRa公司。

儀器：普通離心機(jī)（飛鴿 KA-1000 型，上海安亭科學(xué)儀器廠公司產(chǎn)品），臺式冷凍離心機(jī)（Eppendorf 5810R），移液器（Eppendorf公司產(chǎn)品），普通 PCR儀（Eppendorf Mastercycler personal），MyiQ2 Real-Time PCR System（Bio-Rad公司產(chǎn)品）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 隔王產(chǎn)卵

為了得到基本一致1日齡幼蟲，用隔王框進(jìn)行隔王產(chǎn)卵。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組

實(shí)驗(yàn)分為A、B、C三個組，A組是在王臺中，移入1日齡幼蟲，一直飼喂新鮮蜂王漿直至6日齡幼蟲；B組是在王臺中，移入1日齡幼蟲，前3天飼喂新鮮蜂王漿，后3天飼喂大幼蟲食物直至6日齡幼蟲；C組是在工蜂巢房中，移入1日齡幼蟲后，一直飼喂新鮮蜂王漿直至6日齡幼蟲。這樣A組和B組是發(fā)育空間一樣，營養(yǎng)因素不同；A組和C組是營養(yǎng)因素一樣，發(fā)育空間不同。

1.2.3 人工飼喂幼蟲

吸取0.2ml新鮮蜂王漿（或大幼蟲食物）于王臺或工蜂巢房中，放入培養(yǎng)箱中（溫度35℃，濕度90%）30min，用移蟲針移取1日齡至王臺或工蜂巢房中，幼蟲浮在食物上，每隔12h換一次食物。

1.2.4 樣品采集

每個實(shí)驗(yàn)組取8只發(fā)育正常的6日齡幼蟲，每只幼蟲作為1個樣品，用于dynactin p62基因表達(dá)量的檢測。取樣后蜜蜂幼蟲樣品迅速放入液氮速凍，-80℃保存，用于提取總RNA。

1.2.5 RNA的提取和cDNA第一鏈的合成

每個樣品用液氮研磨后，用 Trizol 試劑盒進(jìn)行RNA 的提取。所有操作均按照試劑盒說明書進(jìn)行，RNA最后溶于30 μL RNA-free的DEPC水中，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計檢測后，放入（80℃保存。用反轉(zhuǎn)錄試劑盒對總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)體系為50 μL：8 μL總RNA，10 μL Buffer，8 μL dNTP，1.5 μL M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶，3 μL Oligo dT，1 μL RNA酶抑制劑，18.5 μL DEPC水。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件如下：體系混勻后，42℃反應(yīng)60 min，75℃ 5 min。反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物保存于（80℃。

1.2.6 熒光定量PCR

定量引物設(shè)計：在中華蜜蜂dynactin p62基因閱讀框區(qū)設(shè)計多對特異引物用于定量 PCR 反應(yīng)，根據(jù)Livak和Schmittgen的方法，本研究對設(shè)計的特異性熒光定量引物進(jìn)行了篩選，獲得符合要求的特異性引物，用于后續(xù)的實(shí)時熒光定量 PCR 反應(yīng)。同時本研究以β-Actin 基因作為內(nèi)參基因（引物為βact-Q-F和βact-Q-R）。熒光定量所用引物序列（表1）。

表1 中華蜜蜂dynactin p62基因引物

熒光定量 PCR 反應(yīng)：qRT-PCR反應(yīng)體系為10 μL：2μL反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，目的基因上游和下游引物各0.3 μL，2.4 μL H2O，5 μL SYBR GreenⅡ；PCR擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性3 min；94℃變性30 s，60.9℃和55.8℃（分別對應(yīng)基因引物和內(nèi)參引物）退火45 s，72℃延伸40 s，40個循環(huán)；72℃延伸10 min；最后以每5 s上升0.5℃的速度從61℃到95℃記錄熔解曲線，每個反轉(zhuǎn)錄cDNA樣品。反應(yīng)結(jié)束后收集目的基因與內(nèi)參基因的CT值。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

收集目的基因（dynactin p62）與內(nèi)參基因（β-Actin）的CT值，用qpcR package，R（Hornik 2011）軟件計算擴(kuò)增效率，計算基因相對表達(dá)量（r）的數(shù)據(jù)分析方法參考Huang等（2012）[9]。

各試驗(yàn)組基因表達(dá)量的差異，采用StatView軟件“ANOVA and t-test”中的“ANOVA or ANCOVA”進(jìn)行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 營養(yǎng)因素對中蜂6日齡幼蟲dynactin p62基因表達(dá)影響

在發(fā)育空間因素不變的情況下，雖然A組和B組3日齡后的幼蟲食物營養(yǎng)因素不同，但兩組6日齡幼蟲dynactin p62基因表達(dá)量差異不顯著（P>0.05）（圖1）。

圖1 營養(yǎng)因素對中蜂6日齡幼蟲dynactin p62基因表達(dá)影響

2.2 空間因素對中蜂6日齡幼蟲dynactin p62基因表達(dá)影響

在發(fā)育營養(yǎng)因素不變的情況下，A組和C組幼蟲發(fā)育空間因素不同，兩組6日齡幼蟲dynactin p62基因表達(dá)量差異顯著（P<0.05）（圖2）。

圖2 空間因素對中蜂6日齡幼蟲dynactin p62基因表達(dá)影響

3 討論

dynactin p62是dynactin蛋白的3個組成部分之一，位于末端，生成的dynactin p62 siRNA能有效干擾外源基因的表達(dá)，同時dynactin p62能識別并連接ATP水解酶，并調(diào)節(jié)其活性。目前蜜蜂的dynactin p62基因的生物功能還不清楚。通過對中蜂dynactin p62基因的克隆和測序可以知道，其基因組DNA序列全長為2 403 bp，cDNA序列全長為1 491 bp，推測蛋白質(zhì)序列為496個氨基酸，與西方蜜蜂dynactin p62的相似性88%[8]。

dynactin p62基因在不同發(fā)育時期中蜂均有表達(dá)，剛羽化雌性蜜蜂的表達(dá)量顯著高于幼蟲期，且工蜂的表達(dá)量顯著高于蜂王；但dynactin p62基因在雄蜂中表達(dá)量沒有明顯的規(guī)律性。這提示dynactin p62基因可能與蜜蜂級型分化有關(guān)[8]。本研究首次研究了發(fā)育營養(yǎng)和空間因素對中蜂6日齡幼蟲dynactin p62基因表達(dá)影響，發(fā)現(xiàn)發(fā)育空間因素顯著影響了中蜂6日齡幼蟲dynactin p62基因表達(dá)量，且是工蜂巢房中幼蟲表達(dá)量高于王臺中幼蟲，這與以前研究結(jié)果一致[8]。同時發(fā)現(xiàn)營養(yǎng)因素沒有顯著影響中蜂6日齡幼蟲dynactin p62基因表達(dá)，這與Weaver 發(fā)現(xiàn)的前3.5天食物質(zhì)量是幼蟲級型分化關(guān)鍵時期相吻合[10]，但詳細(xì)的分子機(jī)理還待進(jìn)一步探討。

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